表達分泌SAC融合肽的重組AAV對前列腺癌CAM移植瘤的治療作用研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　 前列腺癌是男性泌尿、生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，我國近年來前列腺癌發(fā)病率呈上升趨勢。雄激素阻斷療法(ADT)是目前臨床治療前列腺癌及其轉(zhuǎn)移癌的重要手段，但幾乎所有阻斷雄激素治療的患者最終都發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌(CRPC)，ADT不敏感且預后較差。前列腺凋亡反應基因4(par-4)是一種促凋亡基因，其選擇性癌細胞凋亡結構域SAC能在不依賴凋亡刺激的情況下，同時誘導雄激素依賴性和非依賴性前列腺癌細胞凋亡，

2、而不損害正常細胞，表現(xiàn)出良好的腫瘤靶向殺傷效應。腺相關病毒（AAV）具有免疫原性低、安全性好、沒有炎性反應、可同時轉(zhuǎn)染分裂和非分裂細胞及長期穩(wěn)定表達目的基因等優(yōu)點，在基因治療載體研究中受到廣泛關注。雞胚絨毛尿囊膜(CAM)是由胚齡4-5d雞胚的絨毛膜體壁中胚層和尿囊膜臟層中胚層融合而成，胚齡6-7d后CAM及其血管覆蓋整個卵黃囊表面，且隨著胚齡的增加而增大，毛細血管極其豐富，CAM是天然免疫缺陷宿主，可耐受一定的溫度變化，適于移植性腫瘤

3、的生長和生物學行為觀測，常作為移植性腫瘤的實驗模型。
　　 基于SAC對前列腺癌細胞的凋亡誘導機制及應用AAV載體，我們在前期研究中成功構建引入了真核信號肽神經(jīng)營養(yǎng)素4(NT4)和穿膜肽HIV-1反式激活蛋白(TAT)的SAC基因重組腺相關病毒載體rAAV-NT4-SAC-HA2-TAT，本研究旨在建立前列腺癌的CAM移植瘤模型，并將表達分泌SAC融合肽的重組腺相關病毒作用于移植瘤，觀察其表達產(chǎn)物SAC融合肽對前列腺癌CAM移植

4、瘤的抑制作用。
　　 材料與方法：
　　 1.將前列腺癌細胞株PC-3細胞進行復蘇和培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期細胞，離心并用PBS緩沖液調(diào)整細胞濃度為5～8×106個/20μL。取孵育9d健康種雞卵，酒精擦拭卵殼消毒，氣室端開窗，撕去內(nèi)殼膜暴露絨毛尿囊膜，然后將調(diào)整好濃度的PC-3細胞接種到雞胚絨毛尿囊膜上，透明膠帶封閉窗口繼續(xù)孵育。密切觀察移植瘤的生長及誘導血管生成情況。
　　 2.接種后第3天，選取成瘤較好（瘤直徑

5、≥3mm）且生長良好的雞胚，隨機分為3組，每組8只，給予下述不同處理，即空白對照組（PBS組:PBS，100μL/只）、空病毒組(AAV組:AAV，1×109cfu/100μL/只)、重組病毒組(rAAV組:rAAV-NT4-SAC-HA2-TAT，1×109cfu/100μL/只)。在無菌超凈臺內(nèi)按上述設計將相應試劑滴于移植瘤上，透明膠布封窗，繼續(xù)37℃、60％～70％濕度溫箱孵育。觀察移植瘤生長情況，處理4d后測量各組移植瘤的大小，

6、并完整剝離腫瘤，石蠟包埋、切片，免疫熒光法檢測目的基因表達，根據(jù)瘤體積及HE染色比較各組作用效果。
　　 結果：
　　 1.癌細胞接種于CAM后呈彌散樣分布，接種24h后可見接種區(qū)CAM粗糙變厚，邊界清楚。2d后接種區(qū)可見明顯白色瘤團，但瘤周圍毛細血管聚集尚不明顯。3d后瘤體進一步增大，呈團狀生長，可見少量毛細血管聚集。
　　 2.給予處理后PBS組及AAV組移植瘤繼續(xù)生長，可見毛細血管環(huán)形聚集，以瘤體為中心呈彌

7、漫、放射狀分布。rAAV組移植瘤生長情況總體觀察明顯小于對照組。對3組移植瘤體積測量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析顯示:PBS組、AAV組分別與rAAV組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);AAV組與PBS組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。免疫熒光實驗證實SAC融合肽表達。HE染色鏡下見PBS組、AAV組移植瘤生長狀態(tài)相似，瘤細胞呈條索狀浸潤生長，同時伴有新生血管形成，表現(xiàn)出高度侵襲能力;rAAV組移植瘤受到明顯生長抑制，瘤細胞孤立成團，邊