羊口瘡病毒119蛋白誘導細胞凋亡分子機制的研究.pdf

1、羊口瘡病毒(Orf virus，ORFV)，屬痘病毒科副痘病毒屬，是羊傳染性膿皰?。ㄋ追Q羊口瘡）的病原體。ORFV是一種雙鏈DNA病毒，全長138kb，GC含量64％，有132個預測基因，其中病毒的復制、形態(tài)和結(jié)構(gòu)主要由中間保守區(qū)域調(diào)節(jié);而兩端則為相對不保守的基因，這些基因常常與宿主選擇、免疫逃避，免疫調(diào)節(jié)及病毒毒力等相關(guān)。病毒在靶細胞復制過程中，會刺激宿主產(chǎn)生多種細胞因子和趨化因子，參與免疫調(diào)節(jié)、抗病毒等作用。目前已鑒定了一些ORFV

2、的毒性基因，包括IL-10，CBP，VEGF和干擾素(IFN)抗性基因等，其靶標主要為宿主的細胞因子、趨化因子、NF-κB信號途徑和凋亡途徑等。這些毒性因子的協(xié)同作用使ORFV具有很強的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　ORFV125蛋白是文獻報道的第一個ORFV編碼的凋亡相關(guān)蛋白，該蛋白定位于線粒體，能在體外抑制UV誘導的細胞凋亡。也可與Bik，Bim等一系列BH3-only蛋白結(jié)合，中和這些蛋白的促凋亡活性。本課題組前期初步研究發(fā)現(xiàn)ORFV

3、119蛋白定位于線粒體，可抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡，但其具體的分子調(diào)控機制尚不清楚。因此，本研究擬對ORFV119蛋白的功能進行深入的研究，明確其調(diào)控宿主細胞凋亡的作用，并重點研究其發(fā)揮凋亡作用的具體途徑和分子機制。
　　下面分別對本課題的研究方法、研究內(nèi)容和研究結(jié)論進行總結(jié)。
　　方法:
　　第一章中，主要利用CCK8細胞增殖實驗、DAPI染色、TUNEL實驗和流式細胞術(shù)檢測等多種技術(shù)、從不同的角度驗證ORFV11

4、9蛋白誘導細胞凋亡這一作用。第二章中主要采用Caspase激活/抑制實驗和凋亡蛋白芯片技術(shù)初步探討ORFV119誘導細胞凋亡的途徑，之后通過Western blot和ELISA技術(shù)分析驗證ORFV119蛋白誘導細胞凋亡過程中相關(guān)蛋白和細胞因子變化情況，進而闡明ORFV119蛋白誘導細胞凋亡的分子機制。
　　內(nèi)容:
　　第一部分:ORFV119誘導細胞凋亡作用的驗證
　　在293T細胞中高表達ORFV119蛋白，不同時間

5、點利用CCK8法檢測細胞增殖情況;采用兩種不同真核表達載體瞬時轉(zhuǎn)染ORFV119蛋白，不同時間DAPI熒光染色后，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞核形態(tài)變化。轉(zhuǎn)染119GFP和pEGFP-N1后24h采用TUNEL法檢測凋亡細胞DNA斷裂情況。同時高表達ORFV119蛋白后24h，AnnexinⅤ-APC和7-AAD雙染，流式細胞術(shù)檢測凋亡細胞數(shù)。
　　第二部分:ORFV119誘導細胞凋亡機制的研究
　　首先高表達ORFV119蛋白

6、后24h和48h，利用Caspase激活試劑盒檢測ORFV119蛋白對不同Caspase成員的活化程度，初步探討凋亡的分子機制。為了獲得更多凋亡過程中蛋白或細胞因子的變化情況，進行了人凋亡蛋白芯片檢測。之后在高表達ORFV119蛋白的24h和48h，應(yīng)用Western blot和ELISA技術(shù)驗證相應(yīng)蛋白及細胞因子變化水平，進一步明確ORFV119誘導細胞凋亡的分子機制。
　　結(jié)論:
　　本研究通過DAPI熒光染色，流式細胞

7、術(shù)，蛋白芯片，Western blot，ELISA等方法研究了羊口瘡病毒ORFV119的分子功能及其對細胞凋亡的影響和相關(guān)分子機制。研究發(fā)現(xiàn)，ORFV119蛋白定位于線粒體;能抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡;其誘導細胞凋亡作用主要為:ORFV119蛋白可使線粒體表面的促凋亡蛋白Bax和Bak上升，線粒體膜通透性增強，釋放細胞色素C和促凋亡蛋白Smac/Diablo;同時下調(diào)cIAP-2和Bcl-2兩個抑制凋亡蛋白，激活Caspase9;釋放

8、的細胞色素C和活化的Caspase9、Apaf-1因子形成凋亡小體，導致下游Caspase3和PARP的活化使細胞發(fā)生凋亡。同時ORFV119蛋白也可激活Caspase8，再直接活化Caspase3使細胞凋亡，也可使BID活化為tBID通過線粒體途徑發(fā)揮凋亡調(diào)控作用。
　　本研究明確了ORFV119蛋白誘導細胞凋亡的作用并闡明其分子機制，使羊口瘡病毒未知基因功能的探索更進一步。這些結(jié)果有助于研究羊口瘡病毒的致病機制和免疫機理，為疾