實驗性糖尿病大鼠早期腎臟病變的代謝組學研究.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分 實驗性糖尿病大鼠模型的建立和腎臟早期病變的鑒定 目的：建立實驗性糖尿病大鼠動物模型,觀察其腎臟早期病變病程中不同時間點的病理生理特點及變化趨勢,并對早期腎臟病變程度加以鑒定,為后期代謝組學研究提供可靠的實驗模型。 方法：1、健康SD大鼠84只,分為正常對照組36只,糖尿病模型組48只。腹腔注射STZ建立糖尿病模型,2次測定隨機血糖大于16.7mmol/L,定義為糖尿病大鼠。實驗觀察時

2、間為24周,分別于4、8、12、16、20及24周,留取血、尿、腎臟組織標本。2、測定體重、血糖、24小時尿蛋白、血尿肌酐和腎臟重量,計算肌酐清除率及腎重/體重。3、腎臟組織形態(tài)學觀察采用HE染色光鏡檢查。 結果：1、注射STZ 48-72小時后大鼠開始出現(xiàn)多尿、多飲癥狀,并伴有活動減少。2、糖尿病大鼠較正常對照組血糖明顯升高,尿量明顯增加,體重明顯減輕,在各個時間點上均具有統(tǒng)計學意義；兩組24小時尿蛋白排出量、腎重/體重、肌酐

3、清除率均有顯著性差異。3、不同時間點亞組間比較：正常對照組血糖、尿量無明顯差異,體重隨時間延長逐漸增加；糖尿病組各時間點上大鼠體重隨時間延長未見明顯增加,血糖及尿量組間有所差異,但并未體現(xiàn)出具有一定規(guī)律的變化趨勢。正常組大鼠24小時尿蛋白排出量、腎重/體重、肌酐清除率均無明顯差異,DM組24小時尿蛋白排出量呈現(xiàn)出隨病程延長逐漸增加的趨勢；腎重/體重各時間點上有差異,但未見明顯的隨病程進展的變化趨勢；肌酐清除率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。4、

4、光鏡下,NC組大鼠腎小球結構正常,DN可見腎小球基底膜增厚,而部分DM組大鼠僅見腎小球腫脹,而無明顯的基底膜增厚。隨病程進展未見DM大鼠腎臟有時間特異特征性病理學改變,但隨病程進展出現(xiàn)的腎臟病變程度不同,基底膜增厚的程度逐漸加重,并且出現(xiàn)明顯腎臟病理性變化的大鼠的數(shù)目漸增多。 結論：腹腔注射STZ可成功誘導糖尿病大鼠模型,隨時間延長24小時尿蛋白排出量及肌酐清除率呈現(xiàn)規(guī)律性變化,于24周時腎臟出現(xiàn)明顯的病理性改變。因此,STZ誘

5、導的糖尿病大鼠模型可以作為研究糖尿病早期腎臟病變的理想動物模型。 第二部分 糖尿病大鼠腎臟早期病變的代謝組學研究 目的：通過對糖尿病大鼠早期腎臟病變模型血、尿標本的代謝組學研究,尋找糖尿病及糖尿病早期腎臟病變的特征性代謝產物,探尋高血糖對腎臟病變的分子機制。 方法：1、LC/MS方法檢測動物模型血、尿標本的所有小分子代謝產物,描記代謝譜；確定糖尿病早期腎臟病變陽性和陰性病例,采用PLS-DA和OPLS對代謝組數(shù)據(jù)

6、分析,根據(jù)所得小分子物質的質量數(shù)和保留時間,預測與糖尿病早期腎臟病變相關的特征性代謝產物的分子結構,并定量分析其在各組間水平。2根據(jù)獲得的特征性代謝產物的信息,依據(jù)支持向量機理論,以已確定診斷腎臟病變的大鼠代謝組數(shù)據(jù)為訓練集,建立糖尿病大鼠早期腎臟病變的疾病診斷預測數(shù)學模型,對尿蛋白排出量、Kw/BW、Ccr不能明確診斷大鼠進行疾病預測,結果與病理診斷相比較,評價Maker及診斷預測模型的價值。 結果：1、DM與NC組大鼠血清的

7、代謝指紋圖譜有顯著不同,質量數(shù)分別為588.323,566.339,540.321,568.353,303.229,554.341,564.321,339.228,327.229的小分子代謝產物在兩組的水平明顯差異。2、在糖尿病早期腎臟病變陽性及陰性的病例中,血清代謝組學分析獲得特征性的小分子物質,質核比分別為342.1831,314.2246,614.1820,399.3349,450.1936,130.0630,670.3843,3

8、42.1162,822.4051,432.3240,503.1791,898.5402,445.1710,489.1999。尿液標本篩選出的小分子,質核比為700.1428,131.0582,382.1310,552.4331。按荷載圖提示的對區(qū)分糖尿病早期腎臟病變的貢獻大小、與腎病的相關性及物質源性,最終定量分析內源性物質亞鐵血紅素HEME和乙酰氨基丙酸。3、以上述2個marker的指紋圖譜信息作為參數(shù),建立疾病預測的數(shù)學模型,對28

9、只疑診腎臟病變的大鼠進行診斷預測,兩種預測方法結果與病理診斷的陽性吻合率均為94.12％,陰性吻合率是87.50％和81.25％。 結論:LC/MS聯(lián)用的分析技術是研究糖尿病早期腎臟病變動物模型的有效工具；亞鐵血紅素與5-氨基乙酰丙酸水平在糖尿病早期腎臟病變的病理狀態(tài)下有明顯改變,兩者在糖尿病早期腎臟病變的發(fā)病機制中可能起到重要作用。 第三部分 通絡方藥對糖尿病大鼠早期腎臟病變的保護作用 目的：比較通絡方藥不同給

10、藥時間即預防性干預和治療性干預對糖尿病大鼠早期腎臟病變的保護作用及其療效,并從代謝組學角度探討通絡方藥可能的作用機制。 方法：實驗動物48只,隨機分為2組,每組包括NC組6只,DM組8只,TLR組10只,觀察時間分別為12W和24W。兩組TLR大鼠分別于DM造模成功后立即和模型成功后第12周后給予TLR干預,分別定義為預防性給藥組和治療性給藥組。于即定時間處死兩組大鼠,并測定24小時尿蛋白排出量,血肌酐、尿肌酐及腎重計算KW/B

11、W、Ccr;取腎臟組織進行光鏡HE染色病理學檢查。留大鼠血、尿標本代謝組分析。 結果：1、預防性及治療性藥物干預抑制糖尿病大鼠早期腎臟病變所引起的尿蛋白排出和肌酐清除率升高。2、預防性給藥對糖尿病大鼠24小時尿量、尿蛋白排出量、肌酐清除率的改善率分別為59.45％、48.52％、51.40％;治療性給藥組相應指標改善率為21.59％、38.26％、44.29％。3、無論是預防性或是治療性藥物干預,給藥組與糖尿病組代謝產物譜有明顯