利用原生質體融合及基因工程的方法對柑橘采后生防菌34-9遺傳改良的初步研究.pdf

1、生防酵母菌34-9(Kloeckeraapiculata)是本實驗室從自然界中自主分離得到的,對柑橘青、綠霉病具有很強的拮抗作用,但因絮凝性差、生物量低、抗菌譜窄和抑菌活性有待提高等問題,限制了其商業(yè)化應用。為了提高現有生防酵母的綜合性狀,迫切需要對其在基因水平上進行遺傳改良,同時為進一步開發(fā)出新型、安全無毒、多功能的生物保鮮劑提供理論依據。
　　 本研究對菌株34-9的遺傳改良進行了初步探索。采用雙親滅活原生質體融合技術,分析

2、了影響親本菌株34-9和釀酒酵母原生質體制備與再生的主要因素,明確了原生質體制備和再生的最佳條件,確立了原生質體滅活條件,對融合子進行了初步篩選和鑒定。同時利用根癌農桿菌介導的轉化、醋酸鋰法和電轉化的轉化方法,對菌株34-9轉化條件進行了摸索,并對轉化子進行了初步鑒定。主要研究結果如下:
　　 1.利用rDNA-ITS分子鑒定,進一步證實了菌株34-9的屬、種名。確定該菌株為檸檬形克勒克氏酵母(K.apiculata),是有孢漢

3、遜酵母屬(Hanseniasporauvarum)的無性世代。
　　 2.分別確定了菌株34-9和釀酒酵母原生質體制備和再生的適宜條件。菌株34-9原生質體制備和再生的適宜條件:采用0.05mol/LEDTA-Na2和0.5％β-巰基乙醇混合液,28℃預處理10min；培養(yǎng)時間為16h；酶解液濃為1.5％的蝸牛酶,酶解時間為3h；滲透壓穩(wěn)定劑為0.8mol/L的KCl溶液。釀酒酵母原生質體制備和再生的適宜條件:最適產孢培養(yǎng)基為K

4、leyn；培養(yǎng)時間為26h:酶解液濃度為1.5％的蝸牛酶,酶解時間為2h:滲透壓穩(wěn)定劑為0.8mol/L的蔗糖溶液。
　　 3.確立了菌株34-9和釀酒酵母原生質體滅活的適宜條件。菌株34-9化學滅活的參數:0.9％的碘乙酸作用10min；釀酒酵母熱滅活參數:55℃作用15min。在28℃條件下,利用35％PEG-4000作為促融劑進行融合。
　　 4.以菌株34-9和釀酒酵母為親本,進行原生質體雙親滅活和融合,經過菌落