不同缺氧時(shí)間下αB-晶體蛋白對(duì)心肌細(xì)胞凋亡途徑中半胱天冬蛋白酶-3活化的抑制作用.pdf

1、目的： 離體條件下將αB-晶體蛋白基因轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染后心肌細(xì)胞內(nèi)αB-晶體蛋白的表達(dá)；在缺氧/復(fù)氧條件下，觀察隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)αB-晶體蛋白對(duì)原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞中caspase-3的影響。 方法： 1．取出生3天以內(nèi)的SD(Sprague-Dawley)大鼠乳鼠心臟，利用酶消化法和差速貼壁法分離心肌細(xì)胞。通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，采用HE染色法、α-actin免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定

2、培養(yǎng)細(xì)胞類型及心肌細(xì)胞特征。 2．提取pEGFP-C3和pEGFP-αB-crystallin-C3質(zhì)粒，并經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定：以陽(yáng)離子脂質(zhì)體(Lipofectamine<'TM> 2000)介導(dǎo)pEGFP-C3和pEGFP-αB-crystallin-C3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染pEGFP-αB-crystallin-C3)、空載組(轉(zhuǎn)染pEGFP-C3)和空白組(無(wú)任何質(zhì)粒轉(zhuǎn)染)，轉(zhuǎn)染后

3、分別缺氧培養(yǎng)6、12、18小時(shí)后復(fù)氧12小時(shí)，用蛋白印跡法(Westem Blot)半定量檢測(cè)αB-晶體蛋白和caspase-13活化產(chǎn)物p17表達(dá)。 結(jié)果： 1．成功培養(yǎng)出大鼠心肌細(xì)胞并經(jīng)HE染色和免疫組化證實(shí)。 2．成功將αB-晶體蛋白基因轉(zhuǎn)染大鼠的心肌細(xì)胞，熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠色熒光蛋白的表達(dá)，Western Blot檢測(cè)提示蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加(P<0.05)。 3．轉(zhuǎn)染后缺氧培養(yǎng)6、12、1

4、8小時(shí)復(fù)氧12小時(shí)后，轉(zhuǎn)染組心肌細(xì)胞αB-晶體蛋白表達(dá)有下降趨勢(shì)，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義義(P>0.05)；轉(zhuǎn)染組caspase-3活化產(chǎn)物p17與空白組和空載組比較，明顯降低(P<0.05)，在缺氧6-18小時(shí)內(nèi)，隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，有下降趨勢(shì)但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在缺氧12小時(shí)后，各組p17表達(dá)量趨于平穩(wěn)。 結(jié)論： 1．體外條件下成功分離、培養(yǎng)出乳鼠心肌細(xì)胞。 2．將αB-晶體蛋白基因成功轉(zhuǎn)染