腦腫瘤干細(xì)胞及其免疫治療的前期實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、目的意義: 腦腫瘤嚴(yán)重危害人類健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，惡性腦腫瘤占人類所有癌癥患者的2％，占兒童全身腫瘤發(fā)病率的20％～25％，綜合發(fā)病年齡高峰在30～40歲，或10～20歲。其中又以膠質(zhì)細(xì)胞瘤發(fā)病率最高，約占惡性腦腫瘤40.49％。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最常見(jiàn)的成人原發(fā)性惡性腦腫瘤，病人從確診開(kāi)始的中間生存時(shí)間是15個(gè)月，由于膠質(zhì)細(xì)胞瘤分化不全、且深入神經(jīng)細(xì)胞深處，常規(guī)的抗腫瘤措施，包括手術(shù)、放療和化療都很難有效根除，導(dǎo)致其復(fù)發(fā)率較高。最近

2、研究發(fā)現(xiàn)，在腦膠質(zhì)瘤中存在一種數(shù)量極少具有干細(xì)胞的特性的細(xì)胞，正是這類細(xì)胞導(dǎo)致膠質(zhì)瘤產(chǎn)生和復(fù)發(fā)，這類細(xì)胞已經(jīng)定義為腦腫瘤干細(xì)胞(Braintumorstemcells，BTSCs)。 BTSCs存在于惡性腦膠質(zhì)瘤的事實(shí)最早由Ignatova等(2002年)報(bào)道，他們將腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞在神經(jīng)干細(xì)胞(Neuralstemcells，NSCs)培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有克隆形成，其細(xì)胞表達(dá)NSCs標(biāo)記物Nestin，分化細(xì)胞則同時(shí)或單

3、獨(dú)表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuronespecificenolase，NSE)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)和神經(jīng)元β-Ⅲ微管蛋白(neuronalbeta-Ⅲtubulin)等并有基因轉(zhuǎn)錄，提示這類細(xì)胞具有NSCs特性，具有為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的能力因而，把這類細(xì)胞稱為腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞(tumorstem-likecells)，并認(rèn)為其與腫瘤起源和生長(zhǎng)有關(guān)。此后，又有

4、Singh等(2004年)發(fā)現(xiàn)，腦腫瘤中幾乎所有的細(xì)胞增殖均由一小部分表達(dá)人類干細(xì)胞標(biāo)志物CD133+的細(xì)胞即BTSCs產(chǎn)生。在培養(yǎng)基中，這些細(xì)胞可以增殖并分化為神經(jīng)元和(或)膠質(zhì)細(xì)胞，比例、表型與原腫瘤一致。這些新生的腫瘤細(xì)胞又可以在培養(yǎng)基中產(chǎn)生新的腫瘤細(xì)胞，證明它們是腫瘤細(xì)胞而不是被腫瘤樣本污染的正常NSCs。Hemmati等(2003年)對(duì)小兒髓母細(xì)胞瘤和膠質(zhì)瘤進(jìn)行研究，也發(fā)現(xiàn)存在與NSCs性質(zhì)相似的細(xì)胞，它們?cè)隗w外可形成神經(jīng)球，

5、能夠自我更新，且具有多分化潛能，在一定環(huán)境中可分化成具有神經(jīng)元和/或膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志的細(xì)胞，細(xì)胞比例與原腫瘤相似，提示其參與了腦腫瘤的形成；與正常NSCs不同的是，這些細(xì)胞表現(xiàn)出異常的增殖能力，其共同特征是：(1)表達(dá)NSCs特異性標(biāo)記，如Nestin、CD133等；(2)具有自我更新和增殖能力，可以成為永生細(xì)胞；(3)在異體原位移植后，可以分化為與原腫瘤相似表型和核型的腫瘤。 樹(shù)突狀細(xì)胞(dendriticcells，DCs)

6、是體內(nèi)的專職抗原呈遞細(xì)胞，具有活躍地?cái)z取、處理抗原的能力，并表達(dá)高水平的主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)-I、II類抗原和CD80、CD86等共刺激分子，因而能有效地向T細(xì)胞呈遞抗原、激發(fā)初次細(xì)胞免疫應(yīng)答。利用DCs的這一重要功能，基于DCs的腫瘤疫苗是腫瘤免疫治療的重要途徑之一，并結(jié)合BTSCs特點(diǎn)，本研究以臨床膠質(zhì)瘤組織為研究對(duì)象，在分別分離純化鑒定BTSCs及DCs的基礎(chǔ)

7、上、重點(diǎn)探討以BTSCs為免疫原性的DCs融合瘤苗對(duì)膠質(zhì)瘤的免疫殺傷作用，探討免疫治療新方法。DCs疫苗的構(gòu)建方法很多，如腫瘤細(xì)胞mRNA沖擊DCs法、腫瘤細(xì)胞抗原多肽沖擊DCs法、腫瘤細(xì)胞裂解物沖擊DCs法、抗原基因修飾DCs法等。隨著對(duì)腫瘤細(xì)胞融合特性研究的深入以及樹(shù)突狀細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，利用抗原呈遞細(xì)胞(尤其是DCs)和腫瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞疫苗來(lái)誘導(dǎo)抗腫瘤免疫已經(jīng)成為學(xué)術(shù)界的關(guān)注領(lǐng)域。而B(niǎo)TSCs的發(fā)現(xiàn)，又進(jìn)一步為腦膠質(zhì)瘤的免疫治療提供了

8、新的思路。相對(duì)于腫瘤細(xì)胞與DCs融合的腫瘤免疫治療能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)的前期工作，BTSCs與DCs融合的膠質(zhì)瘤免疫治療將更具優(yōu)勢(shì)，更為理想。 本研究將從手術(shù)中獲取的不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本進(jìn)行免疫磁珠分選，得到CD133+和CD133-的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并抽取同一個(gè)病人的外周血，分離得到樹(shù)突狀細(xì)胞，用電融合的方法，分別把CD133+和CD133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞與同源的樹(shù)突狀細(xì)胞融合，融合后的兩種細(xì)胞分別用于刺激同源的T淋巴細(xì)胞，再用這些致敏

9、的T淋巴細(xì)胞，殺傷同源的原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞，觀察該方法是否能更有效的殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞。 二、方法: 本實(shí)驗(yàn)分為三部分： 第一部分：原代CD133+和CD133-的膠質(zhì)瘤細(xì)胞獲得和分選。 收集手術(shù)中取得的膠質(zhì)瘤標(biāo)本，經(jīng)過(guò)剪切、消化等措施，用DMEM/F12培養(yǎng)基加胎牛血清原代培養(yǎng)，培養(yǎng)至第3～5天取部分原代細(xì)胞、用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其中CD133陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)率，再取部分細(xì)胞用免疫磁珠分選法分選其中的CD133+膠質(zhì)

10、瘤細(xì)胞。分選后的CD133+膠質(zhì)瘤細(xì)胞在DMEM/F12培養(yǎng)基加B27、堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal.growthfactor,EGF)和白血病細(xì)胞抑制因子(Leukemiainhibitoryfactor,LIF)等細(xì)胞因子，原代無(wú)血清培養(yǎng)成懸浮腫瘤球后用帶有紅色熒光標(biāo)記物(藻紅蛋白標(biāo)記，Phycoerythrin，PE)的羊抗人CD133抗體

11、標(biāo)記，熒光顯微鏡下觀察。主要觀察和比較CD133+細(xì)胞和CD133-細(xì)胞在第7天、第14天光鏡下20個(gè)隨機(jī)視野膠質(zhì)瘤細(xì)胞腫瘤球的數(shù)目；形成的腫瘤球再放入含有胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，并于第8天用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)貼壁的腫瘤球NSE和GFAP表型。 第二部分：DCs的誘導(dǎo)培養(yǎng)和鑒定。 用淋巴分離液分離膠質(zhì)瘤患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheralbloodmononeuclearcells，PBMCs)，培養(yǎng)2小

12、時(shí)后的貼壁PBMCs，用含有粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor，GM-CSF)和白細(xì)胞介素(Interleukin-4，IL-4)的培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2，的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，第5天開(kāi)始加腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)，刺激DCs成熟，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。在第8～10天收獲成熟的DCs，并用流式細(xì)胞儀檢

13、測(cè)DCs表面的CD14、CD83、CD80、人類白細(xì)胞抗原(HumanleukocyteantigensD-related，HLA-DR)、CD1a和CD86六種表面標(biāo)志物。 第三部分：融合瘤苗的制備，T淋巴細(xì)胞的制備及體外刺激和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。 CD133+和CD133-的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的分選同第一部分。DCs的誘導(dǎo)培養(yǎng)同第二部分。利用電融合的方法將DCs與CD133+和CD133-的膠質(zhì)瘤細(xì)胞分別按5:1的比例進(jìn)行融合。并

14、用DCs與轉(zhuǎn)染有綠色熒光蛋白的膠質(zhì)瘤細(xì)胞融合，通過(guò)熒光顯微鏡下觀察及流式細(xì)胞儀檢測(cè)來(lái)鑒定融合。 用人T細(xì)胞富集液(HumanTcellenrichmentcocktail)(StemCell公司產(chǎn)品)孵育抽取的膠質(zhì)瘤患者同源外周血，再用淋巴細(xì)胞分離液分離這部分外周血，得到T淋巴細(xì)胞；用白細(xì)胞介素(Interleukin-2，IL-2)加入到含有血清的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面CD3分子。

15、 三、結(jié)果: 不同原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞中含有約0.8％～12.4％的CD133+膠質(zhì)瘤細(xì)胞，熒光顯微鏡下示腫瘤球成紅色熒光，表明攜帶有CD133表面分子，CD133+細(xì)胞比CD133-細(xì)胞具有明顯增殖能力，且CD133+細(xì)胞能分化成表達(dá)NSE和GFAP表面分子的腫瘤細(xì)胞。(圖1-1，1-2，1-3)。這類細(xì)胞在膠質(zhì)瘤組織中的含量非常稀少，大部分在1％左右，在惡性程度較高的膠質(zhì)瘤組織(膠質(zhì)瘤病理分級(jí)為IV級(jí))中含量較高，可達(dá)10

16、％以上。養(yǎng)第8～10天的DCs，在倒置顯微鏡下表現(xiàn)為大量突起和毛刺，符合成熟DCs的形態(tài)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，PBMCs標(biāo)志物CD14低表達(dá)，DCs表面標(biāo)志物HLA-DR、CD80、CD86等表面分子高表達(dá)(表2-1)。 四、結(jié)論: 原代膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞經(jīng)免疫磁珠分選法分選后，在含有B27、EGF、bFGF和LIF細(xì)胞因子的DMEM/F12培養(yǎng)基內(nèi)，能成功培養(yǎng)出CD133+細(xì)胞。這類細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)在上述培養(yǎng)基內(nèi)，可增殖成

17、有許多細(xì)胞組成的細(xì)胞球。把這些細(xì)胞球轉(zhuǎn)入含有血清的DMEM/F12培養(yǎng)基內(nèi)后，可貼壁生長(zhǎng)、并向表達(dá)NSE、GFAP的下級(jí)細(xì)胞分化。而CD133-細(xì)胞則很難在上述無(wú)血清培養(yǎng)基內(nèi)長(zhǎng)期分裂增殖。 膠質(zhì)瘤患者外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)GM-CSF、IL-4、TNF-α等細(xì)胞因子刺激誘導(dǎo)培養(yǎng)，可獲取具備典型特征及細(xì)胞表型的成熟DCs。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與DCs經(jīng)電融合，可成功獲得融合瘤苗，融合瘤苗體積明顯增大，具有活化T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的功效。

18、 細(xì)胞毒性殺傷實(shí)驗(yàn)表明，CD133+細(xì)胞與DCs的融合細(xì)胞、CD133-細(xì)胞與DCs的融合細(xì)胞均能明顯活化T淋巴細(xì)胞殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞，而單純DCs、單純膠質(zhì)瘤細(xì)胞以及DCs與膠質(zhì)瘤細(xì)胞混合培養(yǎng)的細(xì)胞則均不能產(chǎn)生顯著的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CytotoxicTlymphocy,CTL)反應(yīng)，兩種融合細(xì)胞分別活化的T淋巴細(xì)胞之間差異沒(méi)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)檢測(cè)IFN-γ釋放量說(shuō)明，融合細(xì)胞能顯著刺激T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ，而兩種融合細(xì)胞