線粒體鈣單向轉運體在缺血預處理心肌保護中的作用及其機制研究.pdf

1、心肌缺血/復灌(ischemia/reperfusion，I/R)損傷是臨床上常見的一種心肌損害現(xiàn)象。1986年Murry等發(fā)現(xiàn)，在對心肌進行長時間缺血前先對心肌進行幾次短暫的非損傷性缺血后，心肌可耐受此后更長時間的缺血，這種短暫的非損傷性缺血稱為缺血預處理(ischemicpreconditioning，IPC)，缺血預處理具有明顯的心肌保護作用。此后的研究發(fā)現(xiàn)，不僅僅在心臟局部進行預處理可以對心臟產(chǎn)生保護作用，對遠離心臟的器官進行缺

2、血預處理同樣也可以減輕I/R對心肌造成的損傷，這一現(xiàn)象被稱為遠距預處理(remotepreconditioning，RPC)的心肌保護作用。無論從何種形式看，缺血預處理都是可以對抗I/R心肌損傷的一種極為有效的手段。雖然已有大量的關于缺血預處理心肌保護作用的研究，但是其確切機理至今仍未完全闡明。 近年來的研究發(fā)現(xiàn)，心肌線粒體內(nèi)鈣在心肌I/R損傷以及心肌預處理心肌保護中具有非常重要的作用，不僅I/R心肌損傷與線粒體內(nèi)鈣超載有密切的

3、關系，而且線粒體鈣穩(wěn)態(tài)在缺血預處理心肌保護中也具有非常重要的作用。線粒體鈣單向轉運體(mitochondrialcalciumuniporter，MCU)是位于線粒體內(nèi)膜上的一個重要的Ca2+轉運體，可以將Ca2+從細胞漿轉運至線粒體基質，在線粒體能量代謝、線粒體Ca2+穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)以及細胞內(nèi)Ca2+信號轉導中具有非常重要的作用，因此我們推測，MCU有可能在心肌缺血/復灌損傷以及缺血預處理心肌保護中發(fā)揮重要作用，但是至今未見相關方面的研究報

4、道。 為了驗證我們的假設，本研究分別利用離體心臟、離體心肌細胞、分離的心肌線粒體和在體動物實驗，重點對MCU在缺血預處理(包括經(jīng)典預處理和遠距預處理)心肌保護中的作用及機制進行了探討。 目的1.觀察MCU在缺血/復灌心肌損傷中的作用； 2.觀察MCU在經(jīng)典的缺血預處理和遠距預處理心肌保護中的作用； 3.研究MCU對線粒體通透性轉換孔(mitochondrialpermeabilitytransitionp

5、ore,MPTP)的調(diào)控以及這種調(diào)控在缺血預處理心肌保護中的地位； 4.研究內(nèi)源性阿片受體激活在遠距預處理心肌保護中的作用，MCU及其MPTP的調(diào)控在阿片受體介導的遠距預處理中的作用。 方法1.用Langendorff灌流裝置記錄離體心臟心室收縮功能及心率； 2.用整體及離體心臟缺血/復灌模型觀察MCU活動在其中的作用； 3.應用局部預處理和遠距預處理模型觀察MCU活動在預處理心肌保護中的作用；

6、4.用TTC染色法測量心肌梗死面積； 5.用分光光度法檢測冠脈流出液和血漿乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)活性以及分離的線粒體標志酶活性； 6.電鏡觀察分離的線粒體形態(tài)結構； 7.原子吸收分光光度法檢測線粒體內(nèi)鈣含量； 8.用線粒體腫脹法在分離的線粒體上檢測MPTP開放； 9.用激光共聚焦顯微術在分離的心肌細胞上檢測MPTP開放； 10.用放射免疫法檢測血漿強

7、啡肽和腦啡肽的水平。 結果第一部分線粒體鈣單向轉運體活動在心肌缺血/復灌損傷中的作用1.在離體灌流的心臟和在體心臟上，分別用MCU抑制劑釕紅(rutheniumred，RR，5μmol/L)和RR(2.5mg/kg)抑制MCU的活動，提高了I/R后心室收縮功能的恢復，減小了心肌梗死面積，減小了冠脈流出液以及血漿中LDH活性。 2.在離體灌流的心臟和在體心臟上，分別用MCU激動劑Spermine(Sper，20μmol/L

8、)和Sper(5mg/kg)激動MCU，增加了冠脈流出液和血漿中LDH活性，心室收縮功能恢復和心肌梗死面積同I/R相比均無明顯差異。 3.在體實驗中，缺血后各組大鼠的平均動脈壓(meanarterypressure，MAP)和心率(heartrate，HR)均減低，復灌后各組MAP與HR均有不同程度的恢復，但各組間無統(tǒng)計學差異。 第二部分線粒體鈣單向轉運體活動在缺血預處理中的作用1.IPC明顯減小了I/R引起的心肌梗死面

9、積和冠脈流出液中LDH活性，復灌期心室收縮功能恢復程度明顯增高。 2.MCU激動劑Sper(20μmol/L)取消了IPC的心肌保護作用，用特異的MCU抑制劑Ru360(10μmol/L)或RR(5μmol/L)預先處理可模擬IPC的心肌保護效應。 3.肢體RPC明顯減小了I/R心肌的梗死面積和血漿中LDH的含量。在進行肢體RPC前用Sper(5mg/kg)激動MCU，結果取消了RPC的心肌保護作用。 4.缺血后

10、各組大鼠的MAP和HR均減低，復灌后各組MAP有不同程度的恢復，各組間無統(tǒng)計學差異。 第三部分線粒體鈣單向轉運體對線粒體通透性轉換孔的調(diào)控作用1.電鏡下觀察到分離的心肌線粒體在腫脹前內(nèi)外膜結構完整，線粒體電子密度較高，而線粒體腫脹后外膜破裂，內(nèi)嵴明顯消失。 2.分離的線粒體內(nèi)膜標志酶琥珀酸脫氫酶和外膜標志酶單胺氧化酶的功能活性明顯高于細胞漿。 3.在分離的心肌線粒體，MCU抑制劑RR(1μmol/L)或Ru360

11、(10μmol/L)抑制了MPTP的開放；用MCU的激動劑Sper(20μmol/L)增強了MPTP的開放。用MPTP的特異阻斷劑環(huán)孢菌素A(cyclosopirneA，CsA)完全取消了后一作用。 4.在分離的calcein負載的心肌細胞，MCU抑制劑RR(5μmol/L)取消了Ca2+誘發(fā)的線粒體calcein熒光的迅速降低，而激動劑Sper(20μmol/L)卻使心肌細胞線粒體內(nèi)calcein熒光的下降程度增加。

12、5.I/R和Sper處理明顯增加了線粒體Ca2+含量，用RR(5μmol/L)抑制MCU和IPC均明顯減小了I/R引起的線粒體內(nèi)Ca2+的升高，而IPC的作用可被Sper所阻斷。 6.復灌期用RR抑制MCU活動明顯減少了I/R引起的線粒體ROS的產(chǎn)生，而用Sper激動MCU使線粒體ROS的產(chǎn)生顯著增加。 第四部分線粒體鈣單向轉運體—線粒體通透性轉換孔調(diào)控在預處理心肌保護中的作用1.用MPTP特異阻斷劑CsA阻斷了MCU激

13、動劑Sper對IPC心肌保護效應的取消作用。 2.在經(jīng)過預處理后分離的大鼠心肌線粒體在520nm下的吸光度下降程度和速率與未經(jīng)預處理的心肌線粒體相比明顯減小。 3.用κ阿片受體激動劑U-50,488H(10mg/kg)或用內(nèi)源性κ阿片受體激動劑強啡肽(300pg/ml)激動心肌κ阿片受體明顯減小了心肌梗死面積，降低了血.漿中LDH的含量。RPC后血漿強啡肽的水平明顯升高。 4.用κ阿片受體阻斷劑nor-BNI(1

14、0mg/kg)阻斷了RPC和U-50,488H的心肌保護作用。 5.δ阿片受體阻斷劑那曲吲哚(1mg/kg)對RPC的心肌保護作用無明顯影響；RPC后血漿中δ阿片受體內(nèi)源性激動劑腦啡肽的水平未見明顯變化。 6.MPTP開放抑制劑CsA取消了nor-BNI對RPC的阻斷作用；MPTP開放劑Atr(5mg/kg)則阻斷了RPC和U-50,488H的心肌保護作用。 結論1.抑制線粒體鈣單向轉運體活動可對抗心肌缺血/復灌