膽囊收縮素在膽管癌神經周圍浸潤轉移中的作用及其分子機制.pdf

1、本文從以下四個方面就CCK對膽管癌惡性生物學行為的影響及其分子機制，以及膽管癌神經周圍浸潤過程中CCK的作用進行了初步研究： 1、培養(yǎng)QBC939膽管癌細胞的形態(tài)學觀察、CCK的影響及其脫落細胞的種植轉移特性的研究。結果顯示：膽管癌細胞傳代接種后，光鏡下可見細胞貼壁、生長、分裂，形成圓形或橢圓形巢狀結構；繼續(xù)培養(yǎng)，可見培養(yǎng)液中出現懸浮細胞并逐漸增多。掃描電鏡下可見，培養(yǎng)細胞相互接觸后，接觸面的細小絨毛減少，變?yōu)檩^粗的纖毛樣或“殘

2、枝樣”突起，而位于多個細胞間的細胞隨著與其它細胞及培養(yǎng)面實際接觸面積的減少，逐漸變圓，最后整個細胞逐漸脫離培養(yǎng)面，成為脫落細胞，漂浮于培養(yǎng)液之中，凋亡小體少見。加入CCK8s后，可見細胞密度、圓形深染細胞較對照組增多，提示CCK8s能夠促進細胞增殖；掃描電鏡可見，CCK8s組細胞集落多不規(guī)則，細胞表面較平滑，絨毛較粗短，細胞間絨毛較對照組明顯為少。CCK8s對細胞的形態(tài)變化，以及細胞間的聯系的影響，提示其可能會對細胞的粘附、轉移特性具有

3、重要作用。對細胞在懸浮狀態(tài)保存、接種并計數的結果表明，脫落的膽管癌細胞并未凋零或死亡，且能夠在懸浮狀態(tài)下仍然保持較長時間的活力，遇到合適的培養(yǎng)面，它可以再次貼附，恢復原來的形態(tài)，并且分裂增殖。這些結果提示，在臨床上對于脫落的腫瘤細胞，重新粘附可能是更為困難的步驟。在體外培養(yǎng)條件下，存在有脫落—漂浮—種植—生長現象，這種現象可能與體內腫瘤具有相同的“細胞脫落—種植轉移”機制。2、膽囊收縮素對人膽管癌細胞粘附、運動及侵襲能力的影響的研究。結

4、果發(fā)現：CCK8s能夠呈濃度依賴方式影響QBC939細胞的粘附、運動和侵襲能力，生理濃度的CCK8s即能夠明顯降低QBC939細胞的粘附、運動和侵襲能力；而CCK1及CCK2受體的拮抗劑L18和L60均能夠明顯減弱CCK8s抑制瘤細胞粘附的作用，提示CCK1及CCK2受體對于QBC939細胞的粘附均具有重要作用。本研究還發(fā)現，外源性的CCK8s與QBC939細胞的運動和侵襲能力呈正相關，L18，L60能夠明顯減弱CCK8s的作用，尤以L

5、60明顯。說明CCK2受體在影響QBC939細胞的運動、侵襲能力方面可能具有較強的作用。 3、膽囊收縮素對人膽管癌細胞侵襲能力的影響的分子機制的實驗研究。結果發(fā)現：CCK8s能夠能夠明顯降低膽管癌細胞QBC939的E-cadmRNA的表達，其CT值相差1.72(3.29倍)個循環(huán)。CCK8s還能夠增加MMP-2、MMP-9mRNA的表達，其中MMP-2增加CT值2.04個循環(huán)(4.11倍)，MMP-9增加CT值3.55個循環(huán)(1

6、1.71倍)。WesternBlot結果表明：CCK8s增加膽管癌細胞QBC939的E-cad的蛋白表達以及基質金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的蛋白表達，這與定量PCR結果相一致。提示CCK8s能夠通過降低腫瘤細胞的粘附，增加膽管癌細胞降解周圍基質的能力，促進膽管癌細胞的浸潤轉移。對膽管癌細胞/Matrigel培養(yǎng)后的Masson染色結果也顯示，腫瘤細胞周圍可見明顯的基質融解環(huán)，顯示膽管癌細胞能夠通過分泌各種蛋白酶降解人工基質。

7、 4、膽囊收縮素對人膽管癌細胞神經周圍浸潤影響的實驗研究。研究結果顯示，在QBC939細胞與DRG/神經細胞共培養(yǎng)模型中，QBC939細胞能夠融解并穿過神經突起周圍的基質成分，靠近神經纖維并貼附其生長，進一步癌細胞可分裂增殖形成包繞神經纖維的細胞團，提示QBC939細胞對神經纖維具有親嗜性，QBC939對神經纖維的浸潤為一主動的、連續(xù)的過程。研究結果還顯示，CCK8s加入DRG/神經—腫瘤細胞培養(yǎng)體系中后，能夠明顯增加腫瘤細胞對神經突

8、起的浸潤，而L18，L60均能夠明顯減弱CCK8s的促進效應，但二者之間差異不明顯。提示CCK能夠促進腫瘤細胞的神經侵襲過程，該作用能夠被其特異的阻斷劑所抑制。實驗結果還顯示，Matrigel能夠較好的滿足小鼠DRG/神經細胞培養(yǎng)的要求，該體系較好的復制了腫瘤細胞穿過細胞基質，浸潤神經纖維的過程，能夠直觀的觀察腫瘤細胞/神經纖維的相互作用，為進一步深入研究腫瘤細胞/神經相互作用提供了較好的模型。 上述結果顯示，膽管癌細胞具有抗脫