高通量測序篩選肝癌細胞中受Dicer調節(jié)的非編碼RNA.pdf

1、目的：
　　Dicer是核糖核酸酶Ⅲ家族成員之一，在RNAi(RNA interference，RNAi)途徑中起著關鍵作用，是microRNA(miRNA)和small interfering RNA(siRNA)生物合成過程中的關鍵酶。非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）是細胞中廣泛存在的、對基因表達起調控作用、但自身不翻譯產生蛋白的RNA分子。ncRNA包括siRNA，miRNA和長非編碼RNA(long

2、 non-coding RNA，lncRNA)等等。
　　近年來研究表明，ncRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，在肝臟中敲除Dicer導致肝癌發(fā)生。因此我們推測受Dicer調節(jié)的ncRNA可能在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。本論文試圖研究在肝癌細胞系中Dicer能夠調節(jié)哪些ncRNA的表達，并用生物信息學方法對這些受Dicer調節(jié)的ncRNA進行初步功能注釋，為后續(xù)深入研究奠定基礎。
　　方法：
　　用RNA干擾技

3、術在HepG2.2.15細胞中抑制Dicer的表達，然后用Illumina測序對Dicer knockdown細胞和對照細胞進行轉錄組和小RNA測序，并運用生物信息學方法對測序結果進行分析。在對原始下機數(shù)據(jù)進行質量控制過濾后，將兩種測序數(shù)據(jù)分別進行基因組比對、基因差異表達、miRNA表達以及靶基因預測等分析，再綜合兩類測序的數(shù)據(jù)和分析結果，從已知的miRNA及其預測靶基因的表達、來源于Rfam的lncRNA表達等方面研究并分析受Dice

4、r調節(jié)的相關ncRNA的表達情況，并進行初步功能分析。
　　結果：
　　整合兩種高通量測序數(shù)據(jù)的分析結果，我們發(fā)現(xiàn)168個成熟體miRNA在樣本間存在顯著性表達差異，并對這些miRNA進行了靶基因預測。同時，在轉錄組水平獲得表達差異顯著的4，019個mRNA記錄，功能注釋結果顯示差異表達基因在細胞表面受體信號轉導通路、G蛋白耦合受體信號通路等多個方面呈現(xiàn)高度富集。將通過小RNA測序得到的差異miRNA的預測靶基因與這4，01

5、9個mRNA記錄進行交叉重疊比較，得到2，284個記錄(＞56％)，即它們不僅是樣本之間表達有顯著差異的miRNA的靶基因，且在RNA水平表達差異顯著。對來源于Rfam-lncRNA的小RNA(sRNA)表達分析結果顯示，來源于7SL RNA的小RNA在樣本間的表達差異顯著。而在重復序列分析中，重復序列的表達總量在兩個測序數(shù)據(jù)中均不存在明顯的樣本間差異。對NATs表達分析的結果表明，來源于NATs的小RNA總量在抑制Dicer的樣品中降

6、低，但在轉錄組水平表達并未顯示出相應上升的趨勢。
　　結論：
　　在對Dicer表達受抑制的樣本和對照組樣本中的RNA測序數(shù)據(jù)進行相關分析和比較后，我們首先發(fā)現(xiàn)多個參考基因和miRNA在樣本間存在差異表達，其中超過一半的差異表達基因是這些miRNA的預測靶基因，因此這些基因在樣本間的表達變化可能是由miRNA的改變引起的，進一步的功能注釋結果顯示受Dicer調節(jié)的基因參與多個生物途徑。此外，Rfam-lncRNA數(shù)據(jù)庫中，7