高通量芯片篩選肝細(xì)胞肝癌拷貝數(shù)變異及相關(guān)基因的研究.pdf

1、第一部分、高通量單核苷酸芯片篩選肝細(xì)胞肝癌拷貝數(shù)變異及相關(guān)基因
　　 目的：探討全基因組拷貝數(shù)變異(Copy number variation，CNV)在肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcmoma，HCC)患者中的變化情況以及與HCC的關(guān)系。
　　 方法：1、用Affymetrix500K SNP(Single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性)芯片檢測(cè)50例試驗(yàn)組(乙型病毒

2、性肝炎(Heptesis B virsus，HBV)陽(yáng)性HCC患者)和50例對(duì)照組(乙型病毒性肝炎陽(yáng)性無(wú)HCC對(duì)照人群)中的CNV；2、在檢測(cè)出的HCC可能相關(guān)的CNV中，隨機(jī)挑選5個(gè)CNV，用實(shí)時(shí)定量PCR(SYBRGreen real-time Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)在282例試驗(yàn)組(乙型病毒性肝炎陽(yáng)性HCC患者)和278例對(duì)照組(乙型病毒性肝炎陽(yáng)性無(wú)HCC對(duì)照人群)中驗(yàn)證芯片篩選結(jié)果。<

3、br>　　 結(jié)果：1、檢測(cè)到HCC可能相關(guān)的拷貝數(shù)變異區(qū)域(CNV regions)共有13個(gè)，其中10個(gè)為拷貝數(shù)擴(kuò)增，3個(gè)為拷貝數(shù)缺失。2、經(jīng)與DGVs數(shù)據(jù)庫(kù)和UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，13個(gè)拷貝數(shù)變異區(qū)域中，6個(gè)與DGVs數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道的存在于正常人群的CNV區(qū)域重疊；2個(gè)與UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道的在一些遺傳病中出現(xiàn)的CNV區(qū)域一致；1個(gè)共存于DGVs數(shù)據(jù)庫(kù)和UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)中；4個(gè)為新發(fā)現(xiàn)的CNV區(qū)域(2q14.3，6q16.1，8q23.2，

4、17q22的擴(kuò)增)。3、發(fā)生率較高的為2個(gè)擴(kuò)增區(qū)域：2號(hào)染色體2p12(64％)和5號(hào)染色體5q34(60％)，以及一個(gè)缺失區(qū)域：15號(hào)染色體15q23(62％)。4、隨機(jī)挑選5個(gè)CNV區(qū)域(2q14.3，5q34，8q23.2，7q11.23，17q25.3)，經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)證實(shí)與芯片結(jié)果一致。5、共檢測(cè)到CNV相關(guān)的HCC可能相關(guān)基因有14個(gè)，其中5個(gè)基因首次在肝細(xì)胞肝癌中報(bào)道。
　　 結(jié)論：肝細(xì)胞肝癌患者中存在CNV

5、，且可能與HCC的發(fā)生有重要關(guān)系，并有可能成為遺傳易感標(biāo)志，同時(shí)有助于尋找HCC的相關(guān)基因。
　　 第二部分、肝細(xì)胞肝癌可能相關(guān)基因相互關(guān)系及功能分類(lèi)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建
　　 目的：探討肝細(xì)胞肝癌可能相關(guān)基因的相互關(guān)系及功能分類(lèi)。
　　 方法：用GO、MAS3.0、DAVID和STRING服務(wù)器在線分析檢測(cè)到的14個(gè)CNV相關(guān)的HCC可能相關(guān)基因，挖掘這些基因可能參與的信號(hào)通路，相互作用方式，功能分類(lèi)與蛋白網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)其在

6、肝細(xì)胞肝癌中可能的作用方式和通路。
　　 結(jié)果：14個(gè)CNV相關(guān)的HCC可能相關(guān)基因主要涉及蛋白磷酸化，質(zhì)膜構(gòu)成，序列變異，可變剪接，轉(zhuǎn)錄，剪接變異，質(zhì)膜，胞外區(qū)，誘變位點(diǎn)，疾病基因突變，胞膜構(gòu)成，有轉(zhuǎn)錄本調(diào)節(jié)活性，二硫鍵，信號(hào)，信號(hào)肽，多態(tài)性，剪接變異體，糖蛋白。STRING分析發(fā)現(xiàn)這14個(gè)CNV相關(guān)的HCC可能相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)中有兩個(gè)重要節(jié)點(diǎn)：GABRG2和KIF2B，且均和癌癥有關(guān)。
　　 結(jié)論：14個(gè)CNV相關(guān)的HC

7、C可能相關(guān)基因在HCC的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用。
　　 第三部分、NOVA1基因和拷貝數(shù)變異區(qū)域14q12以及肝細(xì)胞肝癌關(guān)系的研究
　　 目的：探討拷貝數(shù)變異區(qū)域14q12與相關(guān)基因NOVA1(Neuro-oncological ventralantigen1，腫瘤神經(jīng)腹側(cè)抗原)之間的關(guān)系，以及兩者與HCC之間的相互關(guān)系。
　　 方法：1、實(shí)時(shí)定量PCR4(SYBR Green real-time PCR，R

8、T-PCR)檢測(cè)282例試驗(yàn)組(HBV陽(yáng)性HCC患者)和278例對(duì)照組(HBV陽(yáng)性無(wú)HCC對(duì)照人群)外周血中14q12拷貝數(shù)變異，擴(kuò)大樣本以驗(yàn)證14q12拷貝數(shù)變異與HCC的關(guān)系；2、免疫組化檢測(cè)120例乙肝陽(yáng)性HCC患者的肝癌組織、癌旁組織中14q12拷貝數(shù)變異區(qū)域相關(guān)基因NOVA1的蛋白表達(dá)水平，以了解NOVA1基因與HCC的關(guān)系。3、取40例HBV陽(yáng)性HCC患者的肝癌組織，免疫組化檢測(cè)NOVA1蛋白的表達(dá)，同時(shí)RT-PCR檢測(cè)14

9、q12的拷貝數(shù)變異情況，以了解NOVA1基因與14q12的拷貝數(shù)變異之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：1、RT-PCR結(jié)果示14q12拷貝數(shù)變異區(qū)域在282例試驗(yàn)組中拷貝數(shù)增高，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2、免疫組化結(jié)果示NOVA1蛋白在肝細(xì)胞肝癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3、在40例HBV陽(yáng)性HCC患者的肝癌組織中同時(shí)檢測(cè)14q12拷貝數(shù)變異及NOVA1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示14q12拷貝數(shù)擴(kuò)增的患者其肝癌組織

10、中NOVA1蛋白亦呈高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：1、14q12拷貝數(shù)擴(kuò)增是HCC相關(guān)的拷貝數(shù)變異區(qū)域；2、NOVA1基因?yàn)?4q12拷貝數(shù)變異區(qū)域的相關(guān)基因；3、NOVA1基因是肝細(xì)胞肝癌相關(guān)基因，在肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生中可能起重要作用。
　　 第四部分、NOVA1基因過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響
　　 目的：檢測(cè)NOVA1基因過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　 方法：1、使用逆轉(zhuǎn)錄PC

11、R(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT=PCR)法檢測(cè)(SMMC-7721，HepG2，MHCC97H，MHCC97L，SK-HepG1，PLC/PRF/5)6株肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞株及1株正常肝細(xì)胞株ATCC L-O2中NOVA1基因的表達(dá)，以篩選出低表達(dá)NOVA1的細(xì)胞株；2、構(gòu)建NOVA1基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染低表達(dá)NOVA1基因的細(xì)胞株；3、MTT法檢測(cè)經(jīng)轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞

12、的生長(zhǎng)曲線；4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果：1、SMMC-7721細(xì)胞株和MHCC97L細(xì)胞株為低表達(dá)NOVA1基因的肝癌細(xì)胞株；2、MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了過(guò)表達(dá)NOVA1基因質(zhì)粒的SMMC-7721細(xì)胞和MHCC97L細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的SMMC-7721細(xì)胞和MHCC97L細(xì)胞比較，生長(zhǎng)增殖能力明顯增強(qiáng)：3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了過(guò)表達(dá)NOVA1基因質(zhì)粒的SMMC-7721細(xì)胞和MHCC97L

13、細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡均明顯減弱。
　　 結(jié)論：NOVA1基因可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、抑制凋亡，是肝細(xì)胞肝癌相關(guān)基因，對(duì)肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生可能有重要意義。
　　 第五部分、NOVA1基因干擾對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響
　　 目的：檢測(cè)NOVA1基因干擾對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　 方法：1、使用逆轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reactio

14、n，RT-PCR)法檢測(cè)(SMMC-7721，HepG2，MHCC97H，MHCC97L，SK-HepG1，PLC/PRF/5)6株肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞株及1株正常肝細(xì)胞株ATCC L-O2中NOVA1基因的表達(dá)，以篩選出高表達(dá)NOVA1的肝癌細(xì)胞株；2、構(gòu)建NOVA1基因干擾質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染高表達(dá)NOVA1基因的HepG2細(xì)胞株和MHCC97H細(xì)胞株；3、MTT法檢測(cè)經(jīng)轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖；4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡；5、

15、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞的細(xì)胞遷移能力。
　　 結(jié)果：1、HepG2細(xì)胞株和MHCC97H細(xì)胞株為高表達(dá)NOVA1的肝癌細(xì)胞株；2、MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了NOVA1基因干擾質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞和MHCC97H細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力明顯減弱；2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了NOVA1基因干擾質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞的凋亡更為明顯。3、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了NOVA1基因干擾質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞遷移能力明顯減弱。
　　 結(jié)論：NOVA