組蛋白去乙酰化酶抑制劑聯(lián)合蛋白酶體抑制劑對(duì)伯基特淋巴瘤細(xì)胞株Raji生長(zhǎng)調(diào)控的研究.pdf

1、目的:
　　 伯基特淋巴瘤(Burkittlymphoma，BL)是起源于B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的一個(gè)特殊亞型，為來源于濾泡生發(fā)中心細(xì)胞的高度惡性腫瘤。其腫瘤細(xì)胞倍增時(shí)間短、侵襲性高，臨床上給予大劑量化療可使部分患者治愈。近年來，利妥昔單抗、自體造血干細(xì)胞移植等治療手段的臨床應(yīng)用于治療伯基特淋巴瘤使預(yù)后有所改善，但仍有部分患者難以治愈，急需尋找更為有效的治療手段。組蛋白去乙?；敢种苿?histonedeacetylaseinhi

2、bitor，HDACi)以表觀遺傳為治療靶點(diǎn)，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞組蛋白和非組蛋白的乙酰化水平而調(diào)控基因的表達(dá)，產(chǎn)生細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并可以增強(qiáng)腫瘤對(duì)一些化療藥物的敏感性。蛋白酶體抑制劑通過特異性抑制泛素-蛋白酶體通路，阻斷蛋白酶體對(duì)蛋白的水解，從而阻滯腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及血管生成，進(jìn)而發(fā)揮其抗腫瘤作用，其毒副作用較小，且與常規(guī)化療藥物無交叉耐藥性，可以抑制多種實(shí)體腫瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的增殖。
　

3、　 近年來，關(guān)于兩類靶向藥物聯(lián)合治療套細(xì)胞淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤、急性T淋巴母細(xì)胞白血病及多發(fā)性骨髓瘤研究較多，提示兩藥聯(lián)合應(yīng)用在血液系統(tǒng)惡性腫瘤疾病中有良好的前景。但兩藥聯(lián)合應(yīng)用于人伯基特淋巴瘤細(xì)胞株生長(zhǎng)調(diào)控的基礎(chǔ)研究國(guó)外偶有報(bào)道，國(guó)內(nèi)尚未見相關(guān)報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過研究組蛋白去乙?；敢种苿㎜BH589聯(lián)合蛋白酶體抑制劑硼替佐米(bortezomib)對(duì)人伯基特淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控的影響，探索其作用機(jī)制，以

4、期為臨床治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，尋找伯基特淋巴瘤新的治療手段。
　　 方法:
　　 1.人伯基特淋巴瘤細(xì)胞株raji細(xì)胞培養(yǎng)、傳代
　　 人伯基特淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、飽和濕度、5％CO2條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48-72h傳代一次。此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，懸浮成團(tuán)，臺(tái)盼蘭染色拒染率95％以上。本研究相

5、關(guān)實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Raji細(xì)胞進(jìn)行。
　　 2.MTT法檢測(cè)組蛋白去乙?；敢种苿㎜BH589、蛋白酶體抑制劑硼替佐米及兩藥聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞對(duì)細(xì)胞增殖的影響
　　 2.1LBH589抑制Raji細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
　　 取Raji細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度約為2×105/ml，以每孔90μl接種于U型96孔板，隨機(jī)分為對(duì)照組和LBH589實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入LBH589并使其終濃度為1n

6、M、10nM、102nM、103nM、104nM，對(duì)照組及LBH589實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，分別于加入藥物后第24、48、72h向各孔中加入20μl的MTT（5mg/ml）溶液，繼續(xù)孵育4h，后離心培養(yǎng)板，吸去上清，向各孔中加入150μl二甲基亞砜，振蕩器振蕩至結(jié)晶充分溶解。調(diào)整酶標(biāo)儀至570nm條件下，測(cè)量各組吸光度值。
　　 2.2硼替佐米抑制Raji細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
　　 取Raji細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)

7、胞密度約為2×105/ml，接種96孔板，隨機(jī)分為對(duì)照組、硼替佐米實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為2nM、4nM、8nM、16nM、32nM硼替佐米，余同上述方法。
　　 2.3LBH589+硼替佐米抑制Raji細(xì)胞增殖試驗(yàn)
　　 取Raji細(xì)胞懸液，以約2×105/ml的密度接種96孔板，隨機(jī)分為對(duì)照組、LBH589組、硼替佐米組、LBH589+硼替佐米聯(lián)合用藥組，于加藥后第24h、48h、72h

8、測(cè)量各組吸光度值。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)Annexin(V)/PI標(biāo)記法檢測(cè)LBH589、硼替佐米及兩藥聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響
　　 取Raji細(xì)胞懸液，隨機(jī)分為對(duì)照組、LBH589組、硼替佐米組和LBH589+硼替佐米組，培養(yǎng)箱中孵育36h，后收集細(xì)胞，預(yù)冷(4℃)PBS洗滌，向各管內(nèi)加入5μlAnnexinV/FITC及10μl碘化丙碇(PI)，混勻后于室溫避光孵育15分鐘，使用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)各

9、組Raji細(xì)胞凋亡率。4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LBH589、硼替佐米及兩藥聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞對(duì)Fas蛋白表達(dá)率的影響
　　 取Raji細(xì)胞懸液，隨機(jī)分為對(duì)照組、LBH589組、硼替佐米組和LBH589+硼替佐米組，培養(yǎng)36小時(shí)后收集細(xì)胞，預(yù)冷(4℃)PBS洗滌，加入Fas抗體，室溫、避光反應(yīng)1小時(shí)后加入二抗，應(yīng)用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)Raji細(xì)胞Fas蛋白的表達(dá)率。
　　 5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LBH589、硼替佐米及兩藥聯(lián)合作用于

10、Raji細(xì)胞對(duì)bcl-2蛋白表達(dá)率的影響
　　 取Raji懸液細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組、LBH589組、硼替佐米組和LBH589+硼替佐米組，培養(yǎng)36小時(shí)后收集細(xì)胞，預(yù)冷(4℃)PBS洗滌，加入bcl-2抗體，室溫、避光反應(yīng)1h后加入二抗，應(yīng)用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)Raji細(xì)胞bcl-2蛋白的表達(dá)率。
　　 6.Realtime-PCR檢測(cè)LBH589、硼替佐米及兩藥聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞對(duì)NF-κB的mRNA表達(dá)水平的影響

11、r>　　 取Raji細(xì)胞懸液，隨機(jī)分為對(duì)照組、LBH589組、硼替佐米組和LBH589+硼替佐米組，培養(yǎng)36小時(shí)后收集細(xì)胞，根據(jù)RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒具體實(shí)驗(yàn)步驟檢測(cè)NF-κB的mRNA表達(dá)水平。
　　 7.Westernblot法檢測(cè)LBH589、硼替佐米及兩藥聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞對(duì)NF-κB(p65)蛋白表達(dá)水平的影響。
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Raji細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組、LB

12、H589組、硼替佐米組和LBH589+硼替佐米組，培養(yǎng)36小時(shí)后收集細(xì)胞，提取各組細(xì)胞的總蛋白，取100μg蛋白上樣、SDS-PAGE電泳。印跡轉(zhuǎn)膜后，加入抗NF-κB(p65)抗體孵育，后加入二抗，用顯色劑顯色成像。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT法檢測(cè)組蛋白去乙?；敢种苿㎜BH589、蛋白酶體抑制劑硼替佐米及兩藥聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞對(duì)細(xì)胞增殖的影響
　　 1)人伯基特淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞經(jīng)不同濃度(1

13、nM、10nM、100nM、1000nM、10000nM)LBH589作用24h、48h、72h后，應(yīng)用MTT法檢測(cè)各標(biāo)本吸光度值均有不同程度減低，LBH589對(duì)Raji細(xì)胞株有抗增殖活性。相同處理時(shí)間條件下，隨著LBH589濃度的增加，Raji細(xì)胞抑制率逐漸升高;相同濃度LBH589條件下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Raji細(xì)胞抑制率逐漸升高。對(duì)于Raji細(xì)胞，LBH589作用時(shí)間與濃度對(duì)抑制率均有影響，其效應(yīng)具有時(shí)間-劑量依賴性。2）Ra

14、ji細(xì)胞經(jīng)不同濃度(2nM、4nM、8nM、16nM、64nM)硼替佐米作用24h、48h、72h后，應(yīng)用MTT法檢測(cè)各標(biāo)本吸光度值均有不同程度減低，硼替佐米對(duì)Raji細(xì)胞株有抗增殖活性。相同處理時(shí)間條件下，隨著硼替佐米濃度的增加，Raji細(xì)胞抑制率逐漸升高;相同濃度硼替佐米條件下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Raji細(xì)胞抑制率逐漸升高。對(duì)于Raji細(xì)胞，硼替佐米作用時(shí)間與濃度對(duì)抑制率均有影響，其效應(yīng)具有時(shí)間-劑量依賴性。3）當(dāng)LBH589和硼

15、替佐米聯(lián)用時(shí)，Raji細(xì)胞抑制率明顯升高，如Raji細(xì)胞經(jīng)10nMLBH589、4nM硼替佐米、10nMLBH589+4nM硼替佐米處理24h后，細(xì)胞抑制率依次為(7.53±3.02)％、(10.15±2.83)％、(26.74±2.80)％，兩藥聯(lián)用可以協(xié)同抑制Raji細(xì)胞的增殖。
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)Annexin(V)/PI標(biāo)記法檢測(cè)LBH589、硼替佐米及兩藥聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響:在一定濃度范圍內(nèi)，L

16、BH589單藥或硼替佐米單藥均可以誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡，且隨著提高藥物濃度后細(xì)胞凋亡率有所升高。當(dāng)LBH589和硼替佐米聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞凋亡率明顯增加。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LBH589、硼替佐米及兩藥聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞對(duì)Fas蛋白表達(dá)率的影響:與對(duì)照組相比，LBH589單藥可上調(diào)Raji細(xì)胞Fas蛋白的表達(dá)率，而硼替佐米單藥處理Raji細(xì)胞的Fas蛋白表達(dá)率無明顯變化。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)L

17、BH589、硼替佐米及兩藥聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞對(duì)Bcl-2蛋白表達(dá)率的影響:與對(duì)照組相比，LBH589單藥或硼替佐米單藥均可下調(diào)Raji細(xì)胞bcl-2蛋白的表達(dá)率，當(dāng)兩藥聯(lián)用時(shí)，表達(dá)率明顯下調(diào)。
　　 5.Realtime-PCR方法檢測(cè)LBH589、硼替佐米及兩藥聯(lián)合組作用于Raji細(xì)胞后NF-κBmRNA表達(dá)水平變化:在一定濃度范圍內(nèi)，LBH589單藥或硼替佐米單藥均可下調(diào)NF-κBmRNA的表達(dá)水平，且隨藥物濃度增加NF

18、-κBmRNA表達(dá)水平下調(diào)，兩藥聯(lián)用時(shí)，作用明顯增強(qiáng)。
　　 6.WesternBlot法檢測(cè)LBH589、硼替佐米及兩藥聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞后NF-κB(p65)蛋白表達(dá)的影響:LBH589單藥或硼替佐米單藥均可下調(diào)NF-κB(p65)蛋白的表達(dá)，當(dāng)兩藥聯(lián)用時(shí)，作用明顯增強(qiáng)。
　　 結(jié)論:
　　 1.在一定的濃度范圍內(nèi)，組蛋白去乙?；敢种苿㎜BH589可以抑制伯基特淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋

19、亡，機(jī)制可能與上調(diào)Fas蛋白、下調(diào)bcl-2蛋白和NF-κB(p65)蛋白的表達(dá)相關(guān)。
　　 2.在一定的濃度范圍內(nèi)，蛋白酶體抑制劑硼替佐米可以抑制人伯基特淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能與下調(diào)bcl-2蛋白和NF-κB蛋白的表達(dá)相關(guān)。
　　 3.在一定的濃度范圍內(nèi)，組蛋白去乙?；敢种苿㎜BH589聯(lián)合蛋白酶體抑制劑硼替佐米可以協(xié)同抑制人伯基特淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能