高通量低功率氦氖激光照射誘導細胞凋亡的分子機制研究.pdf

1、低功率激光照射能夠引起多種生物刺激效應，包括細胞增殖，分化以及細胞凋亡。然而到目前為止，關(guān)于低功率激光照射，尤其在較高的激光劑量時引起的細胞層面的分子機制還不是很清楚。為了研究高通量低功率激光照射誘導細胞凋亡的分子機制，我們使用氦氖激光器在633 nm的波長，80 J/cm2或者120 J/cm2的通量下分別對人肺腺癌細胞（human lung adenocarcinoma cells，ASTC-a-1）和猴腎成纖維細胞（African

2、 green monkey SV40-transformed kidney fibroblast cells，COS-7）進行激光照射處理。我們通過監(jiān)測活細胞內(nèi)分子探針H2DCFDA的氧化產(chǎn)物DCF的熒光強度來反映細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的動態(tài)產(chǎn)生過程。我們通過檢測細胞內(nèi)分子探針rhodamine 123的熒光強度變化來反映線粒體膜電位的變化。通過使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluoresce

3、nce resonance energy transfer，F(xiàn)RET），我們在表達SCAT3報告子的細胞內(nèi)監(jiān)測Caspase-3的活性變化。Caspase-8活性的監(jiān)測是通過觀察Bid-CFP熒光報告子的亞細胞定位來實現(xiàn)的。在高通量低功率激光照射誘導的細胞凋亡過程中（120J/cm2，ASTC-a-1），我們觀測發(fā)現(xiàn)了以下級聯(lián)的細胞事件：（1）激光照射后細胞內(nèi)ROS的水平迅速升高，并在60 min之內(nèi)達到最大值。（2）線粒體膜電位的降低

4、發(fā)生在激光照射后15 min的時候，并在50 min的時候達到最低值。（3）Caspase-3的活化維持在激光照射后30～180 min之內(nèi)。我們的實驗結(jié)果還表明高通量低功率激光照射不激活死亡受體通路的關(guān)鍵蛋白水解酶Caspase-8，這表明該凋亡過程直接起始于線粒體ROS的產(chǎn)生和膜電位的降低，不依賴于Caspase-8的活化?？傊?，高通量低功率激光照射誘導細胞凋亡通過觸發(fā)內(nèi)源線粒體途徑，而不是死亡受體途徑。
　　 前面的研究證

5、明高通量低功率激光照射可以通過激活線粒體凋亡途徑誘導細胞凋亡。接下來我們在ASTC-a-1中研究高通量低功率激光照射（120 J/cm2，633 nm）誘導細胞凋亡中線粒體通路的具體機制。我們發(fā)現(xiàn)高通量低功率激光照射引起細胞色素c釋放是由于線觸發(fā)了粒體內(nèi)膜通透性轉(zhuǎn)運孔道（mitochondrial permeability transition pores，MPT pores）的長時間開放所導致的，因為我們發(fā)現(xiàn)MPT孔道的特異性抑制劑環(huán)

6、孢菌素A（cyclosporine，CsA）阻止了細胞色素c的釋放。另外，線粒體對在生理狀態(tài)下線粒體非通透的鈣黃綠素的通透性增加也是高通量低功率激光照射觸發(fā)MPT的另一個有利證據(jù)。高通量低功率激光照射處理后，細胞內(nèi)立刻監(jiān)測到大量的ROS的產(chǎn)生。這種由于激光照射觸發(fā)的光動力反應的產(chǎn)物ROS能夠觸發(fā)MPT孔道的長時間開放，因為ROS清除劑維生素c阻止了這一過程。另外，我們的實驗結(jié)果顯示CsA并沒有完全阻止高通量低功率激光照射誘導的細胞凋亡，

7、說明在該凋亡過程中存在除了MPT之外其他的信號通路。我們發(fā)現(xiàn)，激光照射后Bax的活化發(fā)生在線粒體去極化以及細胞色素c釋放之后，這說明Bax的活化是一個下游的凋亡事件。在CsA存在的情況下，Bax在凋亡的后期仍然被激活，這表明Bax介導的信號通路不依賴于MPT。在高通量低功率激光照射處理后，維生素c，CsA，以及Bax沉默對細胞活力的影響實驗表明MPT介導的信號通路是主要的，而Bax介導的信號通路是次要的。值得說明的是這兩條信號通路都是由

8、大量的ROS的產(chǎn)生觸發(fā)的?？傊?，我們的結(jié)果表明高通量低功率激光照射通過觸發(fā)ROS產(chǎn)生進而導致CsA敏感的MPT孔道的長時間開放來誘導細胞凋亡。與此同時，高通量低功率激光照射還誘導了一條由Bax活化介導的次要信號通路。因此，我們闡明的MPT與ROS之間的關(guān)系是高通量低功率激光照射誘導細胞凋亡的一個重要的基礎(chǔ)。
　　 線粒體是一個動態(tài)的細胞器，它持續(xù)進行著分裂和融合兩個過程以維持其形態(tài)和功能的完整。然而到目前為止，關(guān)于線粒體融合與分

9、裂的具體機制還不是很清楚。本文我們還研究了由高通量低功率激光照射觸發(fā)線粒體氧應激誘導的線粒體動態(tài)變化異常的機制。在高通量低功率激光照射下，我們發(fā)現(xiàn)線粒體呈現(xiàn)過度的片段化結(jié)構(gòu)。且該片段化可以被ROS清除劑維生素c所抑制。進一步的研究表明，高通量低功率激光照射誘導線粒體片段化是通過對融合過程的抑制和對分裂過程的促進兩個方面來實現(xiàn)。具體來說，激光照射后，與線粒體穩(wěn)定結(jié)合的促分裂蛋白Drp1（dynamin-related protein 1）

10、大量增加，說明高通量低功率激光照射可以激活Drp1。值得說明的是，過表達Drp1增加了高通量低功率激光照射引起的線粒體片段化的程度并通過促進細胞色素c的釋放加速凋亡過程。而過表達促融合蛋白Mfn2（Mitofusin 2）起到完全相反的效應。另外，過表達Drp1和Mfn2對線粒體ROS的產(chǎn)生和線粒體去極化都沒有影響。因此，高通量低功率激光照射通過調(diào)節(jié)Drp1和Mfn2的活性進而打破線粒體分裂/融合的平衡，最終導致線粒體片段化以及線粒體與

11、細胞功能的異常。
　　 總之，我們深入研究了高通量低功率激光照射誘導細胞凋亡的線粒體凋亡途徑的具體分子機制：激光通過選擇性激發(fā)線粒體內(nèi)源光敏分子而導致大量ROS的產(chǎn)生。線粒體內(nèi)ROS的大量產(chǎn)生首先造成了線粒體內(nèi)膜MPT孔道的長時間開放，進而導致線粒體內(nèi)膜的通透化以及后序的外膜通透化。促凋亡因子如細胞色素c從線粒體釋放到細胞質(zhì)中會導致下游Caspase-3的活化，并最終導致細胞凋亡。另外線粒體ROS的產(chǎn)生通過調(diào)節(jié)融合/分裂蛋白的活