nm23-H-,1-基因突變對人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981經(jīng)典Wnt信號通路調控機制的影響.pdf

1、本研究的目的是，(1)探討nm23-H<.1>基因突變對人大細胞肺癌細胞株中經(jīng)典Wnt信號通路相關基因mRNA表達水平的影響；(2)探討nm23-H<,1>基因突變對人大細胞肺癌細胞株中經(jīng)典Wnt信號通路相關蛋白表達水平的影響；(3)nm23-H<,l>基因突變對人大細胞肺癌細胞株中經(jīng)典wm信號通路中關鍵激酶GSK-3β活性的影響；(4)nm23-H<,1>基因突變對人大細胞肺癌細胞株體外侵襲力的影響。 材料與方法：在前期研究工

2、作的基礎上，本研究以人低轉移大細胞肺癌細胞株NL9980、人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981、空載體轉染L9981后的L9981-pEGFP細胞株、野生型nm23-H<,l> cDNA基因轉染L9981后的L9981-nm23-H<,1>-pEGFP細胞株、第44位點發(fā)生Ser→Ala點突變的nm23-H<,l>基因轉染L9981后的L9981-nm23-H<,1><'44A>-pEGFP細胞株、第96位點發(fā)生Pr0→ser點突變的nm

3、23-H<,1>基因轉染L9981后的L9981-nm23-H<,1><'P96S>-pEGFP細胞株、第118位點發(fā)生His→Phe點突變的nm23-H<,l>基因轉染L9981后的L9981-rim23-H<,1><'Hll8F>-pEGFP細胞株，第120位點發(fā)生Ser→G1y點突變的nm23-H<,1>基因轉染L9981后的L9981-nm23-H<,l><'Sl20G>-pEGFP細胞株和第96位點發(fā)生ProSer點突變聯(lián)合第

4、120位點Ser→Gly點突變的nm23-Hl基因轉染L9981后的L9981-nm23-H<,I><'P96S+S120G>-pEGFP等9個細胞株作為研究對象，應用RT-PCR和熒光定量PCR檢測上述肺癌細胞株中nm23-H<,l>、GSK-3β、β-catenin，Axin和APC基因mRNA表達水平及其差異；應用Western blot檢測了上述肺癌細胞株胞漿中m23-H<,1>、β-catenin、磷酸化β-catenin、G

5、SK-3β，Axin和APC蛋白表達水平及其差異，胞核中B-catenin，磷酸化β-catenin和GSK-3β蛋白表達水平及其差異；應用免疫共沉淀同位素閃爍計數(shù)檢測了上述肺癌細胞株胞漿和胞核中GSK-3β活性及其差異；應用Boyden小室法檢測了上述肺癌細胞株體外侵襲能力及其差異。 結果：本研究在國內外首次觀察到： 1．上述9個肺癌細胞株中均存在nm23-H<,l>、β-catenin、GSK-3 β，APC和Axi

6、n基因mRNA的表達。 2．NL9980細胞株中nm23-H<,l>，β-catenin、GSK-3 β和APC基因mRNA表達水平均顯著高于L9981細胞株(P<0.01)，但NL9980和L9981細胞株間Axin基因mRNA表達水平無顯著差異(P>0.05)。 3．L9981細胞株中β-catenin和GSK-3β基因mRNA表達水平均顯著低于L9981-nm23-H<,1>-pEGFP細胞株(P<0.05)；但L

7、9981細胞株與突變nm23-H<,1>基因轉染L9981后的5個轉基因細胞株間β-catenin和GSK-3β基因mRNA表達水平比較，均無顯著性差異(P>0.05)。L9981細胞株Axin基因mRNA表達水平顯著高于L9981-nm23-H<,1><'P96S+S120G>-pEGFP(P<0.05)；但L9981細胞株與轉染野生型和其它4個突變rim23-H<,1>基因的轉基因細胞株間Axin基因mRNA表達水平比較，無顯著性差

8、異(P>0.05)；L9981細胞株與L9981-nm23-H<,1><'Sl20G>-pECFP細胞株間APC基因表達水平比較無顯著性差異(P>0.05)：L9981細胞株APE基因mRNA表達水平均顯著高于轉染野生型和突變nm23-H<,l>基因的其它4個轉基因細胞株(P<0.05)。 4．L9981-nm23-H<,1>-pEGFP細胞株與L9981轉染了突變nm23-H<,1>基因的5個轉基因細胞株間nm23-H<,l>

9、基因mRNA表達水平比較，均無顯著性差異(P>0.05)。 5.突變nrn23-H<,1>基因轉染L9981后的5個轉基因細胞株間，以及任何兩個突變nm23-H<,1>轉染L9981后的轉基因細胞株間nm23-H<,1>，β-catenin和GSK-3 β基因mRNA表達水平比較，均無顯著性差異(P>0.05)。但APC和Axin基因mRNA表達水平部分細胞株間有顯著性差異。 6．NL9980與L9981細胞株問胞漿中n

10、m23-H<,l>蛋白表達水平存在顯著性差異(P<0.05)。但野生型nm23-H<,1> cDNA和突變nm23-H<,1>基因轉染L9981后的轉基因細胞株中均存在nm23-H<,1>蛋白表達，其表達水平比較均無顯著性差異(P>0.05)。 7．上述9個細胞株間胞漿中APC蛋白、Axin蛋白表達水平比較，均無顯著性差異(P>0.05)。 8．NL9980和L9981細胞株除胞核中β-catenin表達水平無顯著性差

11、異(P>O.05)外，NL9980細胞株胞漿中β-catenin和GSK-3 β蛋白表達水平、胞核中磷酸化β-catenin和GSK-3 β蛋白表達水平均顯著高于L9981細胞株(P<0.05)；NL9980細胞株胞漿中磷酸化β-catenin蛋白表達顯著低于L9981細胞株。 9．L9981-nm23-H<,1>-pEGFP胞漿中β-catenin和GSK-3 β蛋白表達水平均顯著高于L9981細胞株(P>0.05)，L99

12、81-nm23-H<,1>-pEGFP細胞株胞漿中磷酸化β-catenin蛋白表達水平則顯著低于L9981細胞株(P<0.01)；但L9981-nm23-H<,1>-pEGFP與L9981細胞株胞核中β-catenin比較無顯著性差異(P>0.05)；L998 1-nm23-H<,1>-pEGFP胞核中磷酸化β-catenin和GSK-3 β蛋白表達水平均顯著高于L9981細胞株(P

13、>基因轉染L9981后的5個轉基因細胞株胞漿中β-catenin蛋白表達水平顯著低于L9981-nm23-H<,l>-pEGFP細胞株(P<0.05)；但突變nm23-H<,l>基因轉染L9981后的5個轉基因細胞株與L9981-nm23-H<,l>-pEGFP細胞株間胞核中β-catenin蛋白表達水平比較則無顯著性差異異(P>0.05)。 11．L9981-nm23-H<,l><'s44A>-pEGFP細胞株與L9981-n

14、m23-H<,l>-pEGFP細胞株間胞漿GSK-3 β蛋白表達水平比較無顯著性差異(P>0.05)， 而L9981-nm23-H<,l><'s44A>-pEGFP細胞株胞核中GSK-3 β蛋白表達水平顯著低于L9981-nm23-H<,l>-pEGFP(P轉基因細胞株胞漿和胞核中GSK-3β蛋白表達水平均顯著低于L9981-nm23-H<,l>-pEGFP細胞株(P<0.01)。

15、 12．NL9980細胞株胞漿和胞核中GSK-3β活性均顯著高于L9981和5個突變nm23-H<,l>轉基因細胞株(P<0.01)；但NL9980細胞株與L9981-nm23-H<,l>-pEGFP細胞株間胞漿和胞核中GSK-3β活性比較均無顯著性差異(P>0.05)。 13.NL9980細胞株體外侵襲力顯著低于L9981細胞株(P<0.01)；但NL9980與L9981-nm23-H<,1>-pEGFP和IL9981-nm

16、23-H<,1><'H118F>-pEGFP細胞株間體外侵襲力比較均無顯著差異(P>0.05)；但NL9980細胞株體外侵襲力顯著低于其余4個轉基因細胞株(P<0.05)。 結論：(1)不同轉移潛能人大細胞肺癌細胞株間nm23-H<,1>，β-catenin和GSK-3β基因mRNA表達水平均有顯著性差異；(2)具有不同nm23-H<,1>功能和轉移潛能的人大細胞肺癌細胞株間nm23-H<,1>，β-catenin和GSK-3

17、β蛋白表達水平均有顯著性差異；(3)具有不同nm23-H<,1>功能和轉移潛能的人大細胞肺癌細胞株間GSK-3β活性均有顯著性差異；(4)具有不同nm23-H<,1>功能和轉移潛能的人大細胞肺癌細胞株間其體外侵襲力有顯著性差異；(5)nm23-H<,1>基因第44位Ser→Ala和第118位His→Pho突變對人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981 Wnt信號傳導通路相關基因和蛋白表達水平產生明顯影響，并明顯增加L998l細胞株的體外侵襲能