重金屬Cu2+脅迫下花斑裸鯉鈣調(diào)蛋白磷酸酶的應(yīng)答及其分子調(diào)節(jié)機(jī)理.pdf

1、花斑裸鯉（Gymnocypris eckloni）是分布在青藏高原黃河上游特有魚(yú)類，它不僅具有開(kāi)發(fā)利用的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，更是黃河上游水域中生物多樣性的重要組成部分，具有重要的生態(tài)保護(hù)價(jià)值。近十多年來(lái)，隨著高原工農(nóng)業(yè)發(fā)展和人為活動(dòng)的增強(qiáng)，青海省漁業(yè)水域環(huán)境中重金屬監(jiān)測(cè)指標(biāo)在某些監(jiān)測(cè)斷面的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)上有接近甚至超過(guò)漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)象，對(duì)野生花斑裸鯉存在潛在的影響。因此有必要了解花斑裸鯉在重金屬脅迫下的應(yīng)答機(jī)制，并找到一些生物分子作為生物標(biāo)志物來(lái)準(zhǔn)

2、確、快速監(jiān)測(cè)水域環(huán)境質(zhì)量，為黃河上游水域中魚(yú)類的保護(hù)和恢復(fù)提供理論依據(jù)。
　　本研究通過(guò)反轉(zhuǎn)錄 PCR（reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR）和快速末端擴(kuò)增（rapid amplification of cDNA ends, RACE）方法克隆了6條基因，分析了這些基因在花斑裸鯉組織的表達(dá)分布特征；采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（real-time fluores

3、cence quantitative PCR, Real time PCR）方法，對(duì)在 Cu2+濃度為0.01 mg/L脅迫下花斑裸鯉肝臟、腎臟和鰓組織中白細(xì)胞介素1β（interleukin-1 beta, IL-1β）、腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor-α, TNF-α）和金屬硫蛋白（ Metallothionein, MT）轉(zhuǎn)錄水平應(yīng)答模式進(jìn)行了分析；利用Real time PCR和 Western bl

4、ot方法對(duì)鈣調(diào)蛋白磷酸酶（Calcineurin, CN）轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)模式進(jìn)行了研究，初步推斷CN及其信號(hào)通路參與了 Cu2+脅迫下花斑裸鯉免疫調(diào)節(jié)。結(jié)果如下：
　?。?）克隆得到了 CN大小亞基（CNAα、CNAγ和 CNB）、MT、IL-1β和TNF-α的全長(zhǎng)cDNA序列，分別命名為 Ge-CNAα（KX772783）、Ge-CNAγ（KX772785）、Ge-CNB（KX772784）、Ge-MT、Ge-IL-1

5、β（KX772786）和Ge-TNF-α（KX772787）；RT-PCR結(jié)果表明 IL-1β、TNF-α、MT、CNAα、CNAγ和CNB在各組織中表現(xiàn)出差異性表達(dá)的分布特征。
　?。?）Cu2+脅迫72小時(shí)內(nèi)，肝臟、腎臟和鰓組織中 MT表達(dá)水平比對(duì)照組均有所升高，其中，腎臟中的表達(dá)量最高，其次是肝臟和鰓；IL-1β和 TNF-α表達(dá)水平先下降后上升。初步斷定在 Cu2+濃度為0.01 mg/L時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)花斑裸鯉免疫反應(yīng)的發(fā)生，

6、 MT、IL-1β和TNF-α參與該免疫調(diào)節(jié)。
　?。?）Cu2+脅迫72小時(shí)內(nèi)，肝臟、腎臟和鰓中的 CN大小亞基表達(dá)量均呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)；但CNAα蛋白表達(dá)量表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，表明CN在Cu2+脅迫下產(chǎn)生了應(yīng)答。推測(cè) CN可能通過(guò) NF-AT/NF-κB通路或者結(jié)合 MT上游調(diào)控元件 CN依賴性應(yīng)答元件（CDRE）來(lái)調(diào)控下游基因IL-1β、TNF-α和 MT的表達(dá)。
　　本研究結(jié)果表明，CN及其相關(guān)基因在機(jī)體應(yīng)答重金