4-HPR聯合應用小白菊內酯對肝癌細胞凋亡的作用及分子機制研究.pdf

1、細胞凋亡(apoptosis)，又稱程序性細胞死亡(programmed cell death，PCD)，是由于細胞內外環(huán)境變化或死亡信號觸發(fā)以及在基因調控下所引起的細胞主動死亡的過程。目前已證實多種基因參與了細胞凋亡的調控。研究表明，無論是體外的組織細胞培養(yǎng)還是體內動物實驗，細胞凋亡存在于肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)生、發(fā)展過程中?，F在肝癌的許多非手術性治療方法，如經導管肝動脈栓塞化療術(T

2、ACE)、經皮穿刺瘤內酒精注射術(PEI)、射頻、微波固化(PMCT)、冷凍等都與肝癌細胞凋亡密切相關。因此，通過誘導促凋亡基因表達，可達到治療目的。
　　4-羥基維胺酯(N-4-hydroxyphenyl retinoid，4-HPR)是一種類視黃醇的合成化合物，能抑制腫瘤的發(fā)展，促進腫瘤細胞凋亡，但其誘導細胞凋亡的機制，尚不清楚。NF-κB是一種重要的核轉錄激活因子，與腫瘤細胞的耐藥性和抗凋亡作用密切相關。芳香植物小白菊(Ta

3、nacetumparthenium)以及它的主要生物活性成分－小白菊內酯(Parthenolide)，具有抗菌和抗炎作用，并可抑制NF-κB的激活。盡管上述兩種藥物作用機理方面的研究已涉及到腫瘤細胞分化，信號轉導以及逆轉耐藥等方面，但是4-HPR聯合應用小白菊內酯對人肝癌細胞凋亡的作用及其分子機制尚未見報道。
　　本實驗的目的是研究小白菊內酯對4-HPR誘導腫瘤細胞凋亡的影響，檢測4-HPR誘導肝癌細胞凋亡中的差異表達基因，篩選小

4、白菊內酯引起的細胞凋亡相關基因候選者并探索其作用途徑，為今后肝癌的藥物治療提供依據。
　　本實驗利用TUNEL法及流式細胞儀技術，采用Hep3B和SK-HEP-1兩種肝癌細胞株，觀察小白菊內酯聯合應用4-HPR對肝癌細胞凋亡的作用，并利用凝膠電泳遷移率變化分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)、抗體膠移位分析(supershift assay)和放射自顯影技術檢測NF-κB、NF

5、-κB p65、NF-κB p50、c-Rel、p52及RelB結合蛋白的表達；利用DD－PCR技術檢測4-HPR處理和未處理的Hep3B差異表達基因，進一步確認和篩選凋亡相關基因候選者，并對篩選的cDNA進行克隆，測定基因序列后利用基因庫中的BLAST程序確認；利用半定量反轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)和Northern blotting技術，觀察4-HPR聯合應用小白菊內酯引起人肝癌細胞凋亡過程中差異表達基因，并進行分析。5’-

6、末端快速擴增法(rapid amplification of cDNA ends，RACE)制備上調基因ANKRD1，并克隆到 pEGM-T載體，進行鑒定；利用 PCR技術擴增 ANKRD1基因的正(sense)反(antisense)方向基因，并通過基因重組技術連接到增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因融合表達載體pEGFPC3和 pcDNA3.1/HisA載體。再采

7、用脂質體轉染法，將重組基因轉入 Hep3B和SK-HEP-1兩種肝癌細胞株，同時在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達，對轉染后的肝癌細胞用G418（表達載體帶有neo基因片斷，對G418具有抗藥性）篩選陽性克隆并分析克隆集落形成。在熒光顯微鏡下標記發(fā)光良好的單個克隆，分離克隆繼續(xù)擴增培養(yǎng)建立穩(wěn)定表達ANKRD1基因的細胞系,同時利用Western blotting技術和免疫細胞化學染色方法檢測目的基因蛋白的表達。在激光共聚焦顯微鏡（laser

8、 scanning confocal microscopy，LSCM）下，采用免疫熒光細胞染色法對Hep3B、SK-HEP-1、HepG2和Huh7肝癌細胞進行ANKRD1基因編碼蛋白的定位和表達，并觀察該基因高表達和低表達時細胞核形態(tài)學變化，并利用流式細胞儀檢測高表達ANKRD1基因的細胞凋亡率。
　　本研究的主要實驗方法與結果：
　　1.TUNEL法及流式細胞儀檢測凋亡率：Hep3B和SK-HEP-1兩種肝癌細胞株，分別

9、給予4-HPR(10uM/ml)和4-HPR(10uM/ml)聯合應用小白菊內酯(4uM/ml)，72個小時后通過 TUNEL染色檢測凋亡發(fā)生率，可見其凋亡率隨著藥物的不同升高，4-HPR聯合應用小白菊內酯的細胞凋亡率近2倍高于單用4-HPR組，P<0.01。通過流式細胞儀可觀察小白菊內酯增強4-HPR誘導的腫瘤細胞凋亡，M1期細胞凋亡率明顯高于對照組和4-HPR組，P<0.01，但不影響細胞周期阻滯。
　　2.利用 EMSA方法

10、檢測藥物處理后不同時間 NF-κB的表達：4-HPR處理Hep3B和SK-HEP-1細胞0.2，0.5，1，3，6，12及24h后測定NF-κB表達，結果NF-κB隨4-HPR作用時間延長增高。12h時NF-κB的活性最強。利用NF-κB家族特定抗體進行Supershiftassay結果顯示以NF-κB p65在4-HPR處理的Hep3B細胞中高表達，之后觀察4-HPR(10uM/ml)聯合應用小白菊內酯(4uM/ml)對不同時間Hep

11、3B肝癌細胞NF-κB的影響，結果小白菊內酯有效地阻斷了4-HPR誘導的NF-κB活性，且12h時最明顯。
　　3.利用DD-PCR法檢測4-HPR誘導細胞凋亡過程中基因表達：提取4-HPR處理和4-HPR未處理的Hep3B細胞總RNA，利用DD-PCR技術對大約13000個不同cDNA片斷進行對照分析，并篩選93個差異表達的cDNA，并克隆到TA載體，測定基因序列后利用基因庫中的BLAST程序確認。
　　4.利用North

12、ern blotting和RT-PCR進一步檢測小白菊內酯調控的凋亡相關基因：對DD-PCR檢測出的差異表達基因，通過Northern blot和RT-PCR技術進一步檢測4-HPR聯合應用小白菊內酯時差異表達基因，結果篩選了35個差異表達基因，由小白菊內酯上調18個基因(SNTB1，ALB，PSMD2，RPS23，DNMT，GADD153，SERPIND1，ARPP-19，ND2，ANKRD1和2個未知基因與對照組相比高表達1.5倍)

13、和17個下調基因(Gas5，TF，ND3，CYR61，KTN1和5個未知基因與對照組相比低表達50％)，其中GADD153，NACA，TF和CYR61已證明與NF-κB活性有關。
　　5.克隆基因及確定基因：35個凋亡相關基因，其中一個上調基因HA1A2從肝cDNA中分離克隆測序，結果與Gene Bank中ANKRD1一致，此基因在心肌也稱為是CARP基因。
　　6.構建ANKRD1正(sense，S)反(antisense

14、，AS)方向真核表達載體及在Hep3B和SK-HEP-1細胞內表達：成功克隆了ANKRD1全長基因，并利用PCR技術分別擴增ANKRD1 sense和antisense基因片斷，與pEGFPC3和pcDNA3.1/HisA真核表達載體進行重組，成功構建了 ANKRD1真核表達載體，且在 Hep3B和SK-HEP-1細胞內獲得表達，并通過Western blotting和熒光顯微鏡進行了驗證。
　　7.細胞集落形成：將已構建的真核表

15、達載體轉染到 Hep3B和 SK-HEP-1細胞，用 G418篩選陽性克隆時，觀察到轉染 ANKRD1(S)的細胞克隆集落形成的細胞融合灶與 pEGFPC3和pcDNA3.1/HisA空載體和ANKRD1(AS)相比減少約50%。
　　8. ANKRD1蛋白的定位及細胞形態(tài)改變：將末端標記有綠色熒光蛋白（GFP）的ANKRD1瞬間轉染到Hep3B(S),Hep3B(AS)和SK-HEP-1，HepG2,Huh7細胞并利用鼠的抗AN

16、KRD1的單克隆抗體進行免疫組織化學實驗顯示，GFP融合ANKRD1蛋白主要在胞漿內表達，在細胞核內很少表達；高表達細胞核膜濃縮、碎片狀，引起細胞凋亡；瞬時轉染pEGFPC3-ANKRD1基因的Hep3B細胞通過流式細胞儀分析細胞凋亡結果顯示，空載體pEGFPC3轉染細胞與對照組細胞的凋亡率相比未發(fā)生明顯改變，但轉染pEGFPC3-ANKRD1細胞凋亡率與空載體pEGFPC3轉染細胞與對照組細胞相比有明顯增高，增高至27.5±2.5%。

17、
　　以上結果提示：
　　1.單獨應用小白菊內酯不引起肝癌細胞凋亡，但與4-HPR聯合應用可增強肝癌細胞凋亡，并且與細胞周期阻滯無關。
　　2.小白菊內酯增強4-HPR誘導的肝癌細胞凋亡作用與抑制NF-κB活性有關。
　　3.增加藥物引起的細胞凋亡過程中，篩選出肝癌凋亡相關基因35個，其中一個上調基因HA1A2從肝cDNA中分離克隆并證明與ANKRD1一致。
　　4.成功克隆ANKRD1基因，并構建了ANK