Th17通路在酒精性肝病發(fā)病機(jī)制中的作用及白藜蘆醇對(duì)其治療作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的:初步探討Th17通路在急、慢性酒精性肝病中的作用及白藜蘆醇(Resveratrol，Res)對(duì)其影響機(jī)制的研究。
　　 方法:本實(shí)驗(yàn)采取隨機(jī)-對(duì)照的研究方法。實(shí)驗(yàn)分為慢性組及急性組兩部分，均按照隨機(jī)數(shù)字表將SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分組。(1)①慢性組50只C57BL/6小鼠，自由飲服Lieber-DeCarli對(duì)照液體飼料5天后，隨機(jī)分為Control+橄欖油(olive oil)組、Control+四氯化碳(c

2、arbon tetrachloride，CCL4)組、Alcohol+olive oil組、Alcohol+CCL4+羧甲基纖維素鈉(Carboxymethylcellulose sodium，CMC)組、Alcohol+CCL4+Res組，每組10只。分別給予Lieber-DeCarli液體對(duì)照飼料、酒精飼料（濃度5％）飼喂8周，第8周開始Alcohol+CCL4+CMC組、Alcohol+CCL4+Res組分別給予CMC、Res(4

3、5mg/kg/d)灌胃，9周開始予Control+CCL4組和Alcohol+CCL4+CMC組、Alcohol+CCL4+Res組小鼠2.5％CCL44ml/kg腹腔注射（2次/周），同時(shí)予Control+oliveoil組和Alcohol+oliveoil組橄欖油4ml/kg腹腔注射（2次/周），第10周處死小鼠。②慢性組的研究顯示在酒精性脂肪肝和纖維化組里Th17變化趨勢(shì)一致，為了研究急性ALD中Th17變化情況，設(shè)計(jì)了急性模型:

4、C57BL/6小鼠40只Control組、Alcohol組、Alcohol+CMC組、Alcohol+Res組，每組各10只，分別予Lieber-DeCarli液體對(duì)照飼料及酒精飼料(5％)自由飲服10天，第11天分別給予麥芽糖、酒精5g/kg灌胃，Alcohol+CMC組、Alcohol+Res組分別予CMC、Res45mg/kg預(yù)灌胃，10小時(shí)后處死小鼠。(2)每天觀察小鼠精神狀態(tài)，毛發(fā)光澤度，進(jìn)食、行為情況等，每周測(cè)量小鼠體重。(

5、3)觀察各組小鼠肝臟組織大體形態(tài)變化，記錄肝臟重量，計(jì)算比較肝重指數(shù)變化。(4)應(yīng)用蘇木素伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色和苦味酸天狼猩紅染色觀察肝臟組織病理組織學(xué)改變。(5)檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase，AST)及甘油三酯(Triglyceride，TG)的變化情況。(6)分離肝

6、、脾組織內(nèi)淋巴細(xì)胞，行流式細(xì)胞學(xué)檢查，了解其表面CD4+CD29+、CD4+CD49+表達(dá)情況。(7)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time fluorescent quantitation PCR,Real-timeqPCR)方法檢測(cè)檢測(cè)肝組織中IL-6、TGF-β、α5β1、IL-17、RORγt、STAT3、Socs3、IRF4的表達(dá)情況及白藜蘆醇對(duì)上述指標(biāo)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、慢性模型:與Cont

7、rol+oliveoil組相比，Control+CCL4組血清ALT、AST和TG無改變，Alcohol+oliveoil組ALT、AST和TG升高(P＜0.05);與Alcohol+oliveoil組相比，Alcohol+CCL4+CMC組ALT、AST及TG無明顯變化;與Alcohol+CCL4+CMC相比，Alcohol+CCL4+Res組均明顯下降(P＜0.05)。急性模型:與Control組相比，Alcohol組ALT、AST

8、及TG均顯著升高(P＜0.05);Alcohol+CMC組與Alcohol組比較無差異;Alcohol+Res組ALT、AST及TG表達(dá)無明顯變化。
　　 2、HE染色、天狼星紅染色顯示:慢性組Alcohol+olive oil組、Alcohol+CCL4+CMC組分別形成酒精性肝炎、酒精性肝纖維化;急性組形成急性酒精性肝炎，模型建立成功。
　　 3、流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)顯示:肝臟:與Control+olive oil組比較，

9、Control+CCL4組CD4+CD29+、CD4+CD49+均無明顯差異，Alcohol+olive oil組CD4+CD29+升高(P＜0.05)，CD4+CD49+無明顯改變;與Alcohol+olive oil相比，Alcohol+CCL4+CMC組CD4+CD29+顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05），與Alcohol+CCL4+CMC組相比，Alcohol+CCL4+Res組CD4+CD29+顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

10、P＜0.05)，CD4+CD49+無明顯改變;脾臟:CD4+CD29+、CD4+CD49+在Control+olive oil、Control+CCL4、Alcohol+oliveoil、Alcohol+CCL4+CMC、Alcohol+CCL4+Res組均無明顯變化。
　　 4、q-PCR:慢性模型:與Control+oliveoil組相比，Control+CCL4組IL-17、TGF-β、IL-6、α5β1、RORγt、ST

11、AT3、IR4、Socs3改變不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Alcohol+oliveoil組IL-17表達(dá)升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05），TGF-β、IL-6、α5β1、RORγt、STAT3、IRF4、Socs3無明顯變化;與Alcohol+oliveoil組相比，Alcohol+CCL4+CMC組IL-17、TGF-β、α5β1、STAT3、IRF4、Socs3均明顯升高(P＜0.05），差異顯著，IL-6、RORγt無明顯變化;與A

12、lcohol+CCL4+CMC相比，Alcohol+CCL4+Res組TGF-β、α5β1、IL-17、STAT3顯著降低(P＜0.05)，IL-6、RORγt、IRF4、Socs3無明顯變化。急性模型:與Control組比較，Alcohol、Alcohol+CMC組TGF-β、IRF4表達(dá)升高(P＜0.05），TGF-β、IL-6、RORγt、STAT3、Socs3無明顯變化，與Alcohol+CMC組相比，Alcohol+Res組T

13、GF-β、IRF4顯著下降（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1、通過長期Lieber-DeCarli液體酒精飼料飼喂及聯(lián)合小劑量四氯化碳腹腔注射分別建立慢性酒精性肝炎、肝纖維化模型;短期液體酒精飼料飼喂+酒精灌胃建立急性酒精性肝炎模型。 2、肝內(nèi)淋巴細(xì)胞表面CD4+CD29+表達(dá)與Th17浸潤及促纖維化密切相關(guān)。
　　 3、Th17通路可能在ALD進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，與急性酒精性肝病關(guān)系不明顯。
　　

14、 4、TGF-β可能在酒精所致急性炎癥反應(yīng)、肝纖維化形成中均發(fā)揮重要作用。
　　 5、α5β1可能在酒精性肝纖維化形成中發(fā)揮重要作用。
　　 6、在ALD中，IL-17表達(dá)可能受STAT3、Socs3調(diào)節(jié)，但Socs3具體作用機(jī)制尚不明確。
　　 7、Res可能通過下調(diào)肝內(nèi)淋巴細(xì)胞CD29及組織STAT3表達(dá)抑制Th17通路發(fā)揮抗纖維化作用。
　　 8、Res可能通過抑制TGF-β表達(dá)在急、慢性酒精性肝