機(jī)械通氣所致急性肺損傷對(duì)大鼠晝夜節(jié)律改變和肺組織基因表達(dá)的影響.pdf

1、背景和目的
　　機(jī)械通氣肺損傷(ventilation-inducedlunginjury,VILI)是一種伴有細(xì)胞因子釋放的廣泛肺泡毛細(xì)血管膜的損傷,其發(fā)生率約占機(jī)械通氣的5％-39%。VILI的發(fā)生涉及到傳統(tǒng)的氣壓傷、容積傷、不張傷,以及生物性損傷。但VILI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,迄今尚未完全闡明。目前很多報(bào)導(dǎo)指出肺腫瘤、慢性肺阻塞性疾病、哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病以及缺血缺氧性腦損傷打破機(jī)體晝夜節(jié)律性而致病,運(yùn)用時(shí)間療法能有效診治。VIL

2、I作為呼吸系統(tǒng)急性損傷,晝夜節(jié)律失衡亦可能是其發(fā)病機(jī)制之一。另外VILI是全身炎癥反應(yīng)的一部分,或是針對(duì)肺組織的特異反應(yīng),由多種細(xì)胞和因子參與,伴隨著多個(gè)基因和通路的表達(dá)。研究這些基因和通路,對(duì)于闡明VILI的發(fā)病機(jī)理具有重要意義?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了許多這方面的基因,但我們還需要在全基因組的水平上進(jìn)行檢測(cè),以全面研究VILI相關(guān)基因的表達(dá)?；蛐酒?genechip或DNAmicroarray)作為一種高通量、高效能的篩選工具,是研究基因表達(dá)的

3、有效方法。本研究采用全基因表達(dá)譜芯片技術(shù),篩選VILI大鼠差異表達(dá)基因,并分析這些基因的功能以及是否與晝夜節(jié)律相關(guān)基因關(guān)聯(lián),以進(jìn)一步探討VILI發(fā)病的分子機(jī)制。
　　材料和方法
　　1VILI模型的制備以及晝夜節(jié)律變化的探討
　　72只SD大鼠,適應(yīng)性飼養(yǎng)(12h-day/12h-night)2周,將大鼠按照預(yù)進(jìn)行通氣處理的四個(gè)時(shí)間點(diǎn)(1AM,7AM,1PM,7PM)隨機(jī)分為四個(gè)組,每組18只,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)再隨機(jī)分為三組

4、(FB組n=6、LV組n=6、HV組n=6):FB組,自由呼吸組,不予機(jī)械通氣干預(yù);LV組,保護(hù)性機(jī)械通氣組,給予Vt8ml/Kg,PEEP0mmHg;HV組,大潮氣量通氣組,給與Vt40ml/Kg,PEEP0mmHg。共維持3h。監(jiān)測(cè)每只大鼠的平均動(dòng)脈壓、心率、血?dú)庾兓?h后放血處死大鼠,并留取標(biāo)本。HE染色觀察大鼠肺組織,并運(yùn)用液相芯片技術(shù)檢測(cè)血漿促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、褪黑素(MT)水平。
　　2基因芯片技術(shù)篩選大鼠

5、VILI差異表達(dá)基因
　　選取1AM、1PM時(shí)間段FB組及HV組雄性大鼠,每組大鼠的不同時(shí)間段肺組織提取RNA,等量混合,采用Affymetrix公司的RatGenome2302.0Array,檢測(cè)大鼠的基因表達(dá)譜。在基因芯片結(jié)果中,選取Cyp1a1、Npas2、Nr1d13個(gè)差異基因,并對(duì)72只大鼠行RT-PCR,檢驗(yàn)表達(dá)譜芯片的準(zhǔn)確性,并進(jìn)一步探討VILI的分子機(jī)制。
　　3統(tǒng)計(jì)分析
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x

6、±s)表示?；蛐酒y(tǒng)計(jì)分析參照Affymetrix文件。其余統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SAS9.1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01表示差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。定量資料經(jīng)正態(tài)和方差齊性檢驗(yàn)后,組間比較采用單因素方差分析(OneWayANOVA),多因素方差分析,組內(nèi)兩兩比較采用Tukey法進(jìn)行。利用余弦節(jié)律函數(shù)F(t)=M+Acos(ωt+Φ)構(gòu)建模型并進(jìn)行節(jié)律分析,P<0.05,說明模型擬合,節(jié)律存在且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

7、義。Mesor代表余弦模型中的M值,Amplitude代表A值,通過A/M值判定,比值越高,說明節(jié)律性越強(qiáng)。
　　結(jié)果
　　1.動(dòng)脈血壓、心率、MT組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,余弦分析無節(jié)律性,P>0.05。ACTH組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01。
　　2.動(dòng)脈血?dú)庾兓?實(shí)驗(yàn)前3組大鼠動(dòng)脈血pH值、PaCO2和PaO2的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P>0.05;3h通氣處理后,HV組的PaCO2明顯降低,P<0.05。

8、>　　3.肺損傷評(píng)分,與FB組、LV組比較,HV組的肺損傷評(píng)分具有顯著的差異,P<0.01。
　　4.基因芯片檢查差異表達(dá)基因:HV組與FB組比較,共同差異基因56個(gè),其中上調(diào)43個(gè),下調(diào)13個(gè)。Il-6、Cox-2、Ccl2基因表達(dá)上調(diào)。對(duì)差異基因進(jìn)行功能分類有以下幾種:a.炎癥相關(guān)基因,b.代謝相關(guān)基因,c.免疫相關(guān)基因,d.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因,e.其它如氧化抗氧化基因等。
　　5.RT-PCR檢測(cè)Cyp1a1、Npas2

9、、Nr1d1基因,與基因芯片表達(dá)趨勢(shì)相同。相對(duì)于FB組及LV組,HV組Nr1d1基因表達(dá)顯著下降,p<0.05。余弦分析Nr1d1基因在FB組具有節(jié)律性,P<0.05,余未見明顯節(jié)律性。
　　結(jié)論
　　1.本文成功地建立機(jī)械通氣肺損傷的大鼠在體模型(VILI),探討了機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷的病理生理改變及其可能原因與機(jī)制,為后續(xù)研究提供依據(jù)。
　　2.血漿ACTH水平在機(jī)械通氣中存在組間差異,本次實(shí)驗(yàn)未見MT、ACTH存