特異2’OMe修飾siRNA對前列腺癌DU145細胞VEGF表達及細胞增殖凋亡的影響.pdf

1、目的：篩選有效的干擾序列，研究靶向血管內(nèi)皮生長因子(Vascuar endothelial growth factor, VEGF)的特異性小干擾RNA(siRNA)對人前列腺癌DU145細胞增殖及凋亡的影響為針對VEGF基因的RNA干擾提供新的有效的作用靶位，為針對VEGF的前列腺癌基因治療提供新的途徑。
　　 方法：1．設計并體外化學合成3對針對人VEGF基因的特異性siRNA和綠色熒光素標記的FAM-siRNA作為陰性對照

2、序列，并對siRNA進行特異2'OMe修飾。
　　 2．利用脂質體轉染法將FAM-siRNA轉染入人前列腺癌DU145細胞；通過熒光顯微鏡檢測表達綠色熒光素的DU145細胞，評估siRNA的轉染效率：通過脂質體法轉染3對siRNA，并設置空白對照組和陰性對照組，收集轉染48小時后的DU145細胞提取總RNA，利用RT-PCR技術測定各組轉染不同序列siRNA的DU145細胞VEGF的mRNA表達水平，篩選出具有最大抑制作用的特異

3、性siRNA作為最佳序列；隨后將不同濃度的已篩選出的最佳序列siRNA轉染入DU145細胞，利用RT-PCR法檢測其VEGF mRNA的表達，篩選其最佳轉染濃度。
　　 3．將以最佳濃度的最佳序列siRNA轉染入DU145細胞，48小時后收集細胞并提取總蛋白，利用Western Blot法檢測其VEGF蛋白表達水平，計算抑制率；四甲基偶氮唑藍法(MTT)法檢測其細胞增殖，Annexin V-PI法檢測細胞早、晚期凋亡情況。

4、>　　 結果：熒光顯微鏡觀察檢測顯示，F(xiàn)AM-siRNA轉染效率大于75％；以200nM濃度轉染人前列腺癌DU145細胞，siRNA-1和siRNA-3轉染組VEGF mRNA的表達水平有不同程度的下調，其中以siRNA-1轉染組下調最明顯，表達率約為(42.4±6.8)％，與空白對照組、陰性對照組、siRNA-2組和siRNA-3相比，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，選為最佳特異性siRNA;以三種濃度(100nM、200nM、3

5、00nM)轉染siRNA-1至DU145細胞，當濃度為300nM時，VEGF基因的干擾效率達到最高，其VEGF mRNA表達率約為(22.1±13.6)％，與空白對照組、轉染100nM、200nM濃度組相比，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Western-blot法檢測以300nM濃度為最適轉染濃度轉染siRNA-1，其VEGF蛋白表達率約為(26.8±10.5)％，與空白對照組、陰性對照組比較，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);MT