RNA干擾靶向抑制表皮生長因子受體對大腸癌細胞增殖和化療敏感性影響的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建針對EGFR的短發(fā)卡狀RNA質(zhì)粒表達載體，觀察能否有效抑制大腸癌LoVo細胞株表皮生長因子受體(EGFR)的表達以及對細胞增殖的影響。確定有效的序列后，觀察雙位點的RNA干擾技術(shù)較單位點RNA干擾技術(shù)在抑制大腸癌LoVo細胞表皮生長因子受體(EGFR)的表達，誘導(dǎo)細胞凋亡以及增強5-氟尿嘧啶(5-FU)化療敏感性等方面是否有更明顯的效果。 方法：體外合成EGFR短發(fā)卡狀雙鏈RNA和Pgenesil-1質(zhì)粒構(gòu)建兩個表達載

2、體pU6-EGFR-shRNA-1和pU6-EGFR-shRNA-2，脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染人大腸癌LoVo細胞后24，48，72，96，144小時RT-PCR和Western-blot檢測EGFRmRNA和蛋白的表達，流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡，并繪制細胞生長曲線；確定兩個質(zhì)粒載體都能夠進行有效干擾后，再以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人大腸癌LoVo細胞，G418篩選4周，分5組：1組：LoVo細胞；2組：對照質(zhì)粒載體HK；3組：pU6-EGFR-shRNA

3、-1；4組：pU6-EGFR-shRNA-2；5組：pU6-EGFR-shRNA-1和pU6-EGFR-shRNA-2各半量。實時熒光定量PCR和Western-blot檢測mRNA和蛋白的表達，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，細胞增殖分析試劑CCK-8(CellCountingKit-8)測定5-FU不同濃度和時間對LoVo細胞的抑制率和IC50。 結(jié)果：正確地構(gòu)建了兩個shRNA質(zhì)粒表達載體，細胞轉(zhuǎn)染成功；轉(zhuǎn)染shRNA后LoVo

4、細胞的mRNA和蛋白表達降低，G0-G1期細胞增加，S期細胞減少，細胞凋亡率增加，對數(shù)生長期延遲，以48-72小時效果最顯著，但隨著時間的推移其干擾作用降低。進行G418穩(wěn)定篩選后，PCR檢測3組4組5組mRNA表達分別下降了(80.2±3.4)％、(81.3±2.8)％和(90.6±2.8)％，Western-blot檢測蛋白表達分別下降了(74.1±4.0)％、(73.4±2.3)％和(90.4±3.3)％，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率

5、增加了(10.4±0.5)％、(10.1±0.4)％和(14.2±0.5)％，同時對5-FU的IC50和細胞抑制率作統(tǒng)計學(xué)分析：5組，3組4組和1組2組三者之間比較有顯著性差異，而1組2組間、3組4組間各項比較差異無顯著性。 結(jié)論：構(gòu)建的質(zhì)粒載體可以成功的進行RNAi實驗，兩條EGFR-shRNA均可有效抑制大腸癌LoVo細胞EGFR表達，阻滯更多的細胞位于G0-G1期，促進細胞凋亡而抑制細胞增殖，并且能提高5-FU對癌細胞的殺