不同組分固定液對組織保存效果影響的研究.pdf

1、研究背景：
　　在組織處理過程中，組織的固定至關重要。在過去的一百年中甲醛是國際上通用的組織固定液，但是用甲醛固定組織主要存在以下缺點：①易揮發(fā)，有毒。②易引起組織內形成廣泛的蛋白質交聯(lián)，影響免疫組織化學染色中抗原決定簇的暴露。③易導致DNA斷裂，交聯(lián)作用阻礙核酸的提取并局限了DNA片段的PCR擴增產物的長度。近年來，隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展及疾病相關基因研究的不斷深入，分子病理學檢測已成為病理診斷的重要輔助手段。在形態(tài)學、免

2、疫組織化學、相關遺傳物質保存等方面優(yōu)于甲醛的綠色環(huán)保固定液成為研究熱點。
　　研究目的：
　　探討不同成份固定液對組織形態(tài)學的保存、組織化學、免疫組織化學染色以及對提取組織DNA片段長度完整性的影響。
　　研究方法：
　　1.固定液的配制：本實驗室內配制三種無醛固定液：①R固定液（以RCL-2固定液主要成分為參考）；②U固定液（以UMFIX固定液主要成分為參考）③W固定液(以Weigners fixative主要

3、成分為參考)，④對照固定液F（4％中性甲醛固定液）。
　　2.標本收集：收集外科手術送檢的新鮮標本48例：胃癌9例，直腸癌5例，肺癌6例，正常甲狀腺10例，正常乳腺10例，子宮肌瘤8例。按照《臨床技術操作規(guī)范（病理學分冊）》的要求，腫瘤標本選取正常組織與腫瘤組織交界，正常標本選取正常組織分別切取2cm×1.5cm，厚度為3mm的組織塊4塊，裝入包埋盒中，分別置于固定液R、固定液U、固定液W、以及4%中性甲醛固定液（F）中，于室溫下

4、固定12小時，常規(guī)脫水，石蠟包埋。3μm連續(xù)切片粘附于載玻片，用于HE染色，形態(tài)學觀察。6μm連續(xù)切片5片存于1.5ml的Eppendorf管中用于DNA提取，PCR擴增，GAPDH基因檢測。
　　3.組織形態(tài)學評判：切片進行 HE染色，從整體形態(tài)、整體染色、核染色、細胞輪廓、紅細胞的完整性、細胞質染色等6個方面給出評分，并比較不同組分固定液對組織形態(tài)學的保存效果的影響。
　　4.組織化學染色（特殊染色）：PAS染色比較不同

5、組分固定液對中性黏蛋白保存效果；MASSON三色染色、網狀纖維染色和彈力纖維染色比較不同組分固定液對纖維結締組織的保存效果和染色效果的影響。
　　5.免疫組織化學染色：CK、EMA、SMA、Desmin、P63、34βE12、TTF-1、Cadherin-E、CK7染色、評分，并比較不同組分固定液對抗原保存效果的影響。
　　6.基因組DNA提取及驗證：行OD260及OD260/OD280對提取的DNA濃度、純度、完整性進行檢

6、測及GAPDH基因PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳，觀察PCR產物擴增的效果，評估其模板的完整性來比較不同組分固定液對 DNA保存效果的影響。
　　結果:
　　1.組織形態(tài)學染色：整體形態(tài)和整體染色及核染色上，R組獲得了最高分數(shù)（整體形態(tài)得分：3.44；整體染色得分：3.45；核染色得分：3.25）；F組獲得了最高的細胞輪廓得分（3.26）和最高的紅細胞完整性得分（3.31）；W組得分最低，與其他三組差異明顯（P<0.05）。<

7、br>　　2.組織化學染色：
　　胃組織PAS染色中：F組PAS染色中陽性物質呈現(xiàn)很強的紫紅色；R組陽性物質有溶解的跡象出現(xiàn)，而且在細胞內的分布有偏向細胞一極聚集的現(xiàn)象發(fā)生；U組染色色彩鮮艷；W組陽性物質著色暗淡。
　　甲狀腺膠質在PAS染色中：F組染色暗淡；R組和W組膠質收縮明顯；U組呈現(xiàn)均質狀。
　　Masson染色中：U組和R組顏色深而鮮亮，肌纖維的紅色著色和膠原纖維的綠色著色對比鮮明，F(xiàn)組和W組染色暗淡，各種纖

8、維染色對比不明顯。
　　彈力纖維染色：F組和U組彈力纖維著色清晰，背景干凈；而R組和W組彈力纖維分布雜亂，斷裂，染色背景相對模糊。
　　網狀纖維染色：R組背景干凈，網狀纖維顯示清晰；F組出現(xiàn)過染現(xiàn)象；U組染色較差，網狀纖維難以辨認；W組背景染色較深，僅顯示出少量的網狀纖維。
　　3.免疫組織化學染色：
　?、貱K、EMA、SMA、Desmin、P63、34βE12、TTF-1：F組與R組各指標得分無明顯差異,與U

9、組及W組顯著性差異（P<0.05）。
　?、贑adherin-E：F組和R組、U組、W組得分有顯著性差異（P<0.05）；
　?、跜K7：F組和U組及R組得分在統(tǒng)計學上無明顯差異（P>0.05），F(xiàn)組和W組的差異明顯（P<0.05）。
　　4.抽提的組織基因組DNA含量：R組DNA含量最高（OD260=0.029）（P<0.05），依次為U（OD260=0.025）、W（OD260=0.021）、F（OD260=0.0

10、20）；OD260/OD280比值均沒有明顯差異（P＞0.05）。
　　5.GAPDH基因PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳：
　?、偃橄俳M織：R組、U組均有明顯的目的DNA擴增條帶，W組目的條帶不清晰，F(xiàn)組幾乎沒有目的條帶；
　　②甲狀腺組織：R組、U組、F組均能看到清晰目的條帶，F(xiàn)組出率較低；W組沒有目的條帶；
　?、畚附M織：R組、W組均有清晰目的條帶，F(xiàn)組目的條帶比較模糊，U組幾乎沒有目的條帶；
　?、苣c組

11、織： R組、U組、W組目的條帶清晰可見，F(xiàn)組目的條帶很淡；
　?、葑訉m組織：R組、U組都能看到清晰的目的條帶，W組條帶比較模糊，F(xiàn)組幾乎沒有目的條帶；
　?、薹谓M織：R組能看到清晰的目的條帶，U組次之，U組條帶比較弱，W組目的條帶不清晰且雜亂，F(xiàn)組目的條帶出率很低。
　　結論：
　　1、甲醛仍是形態(tài)學保存效果最好的固定劑。
　　2、甲醛固定液和U固定液對糖類和彈力纖維的保護能力較好，而在網狀纖維保護方面，R