人GL50基因轉染細胞的構建及功能性鼠抗人GL50單克隆抗體的研制.pdf

1、GL50(CD275，inducible costimulator ligand)分子是B7家族的新成員，與其特異性受體ICOS(CD275，inducible costimulator)分子結合所提供的共刺激信號在T細胞的活化、增殖、細胞因子的分泌以及B細胞的增殖、分化、抗體產生等方面發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。GL50信號參與了機體的移植排斥反應、抗腫瘤免疫、抗感染免疫、自身免疫性疾病和過敏反應等眾多免疫過程。轉染人GL50基因細胞及鼠抗

2、人GL50單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)的研制能夠為進一步研究GL50在機體免疫應答中的作用以及與其他共刺激信號通路之間的關系提供有力的工具，從而深入探討機體免疫應答的本質，同時也為臨床相關的疾病診斷、治療和預防提供了新的手段。
　　 第一部分轉染人GL50基因細胞株的建立及其對T細胞體外增殖與活化的促進作用
　　 從人B淋巴瘤細胞株Daudi中抽提總RNA，采用RT-PCR的方法，把總RN

3、A逆轉錄成cDNA并大量擴增目的基因。將目的基因插入pIRES2-EGFP載體中并測序，通過脂質體轉染技術將重組載體pIRES2-EGFP-GL50轉染L929細胞。用G418篩選并通過流式細胞術與RT-PCR的方法反復鑒定，最終獲得了穩(wěn)定高表達GL50分子的L929/GL50基因轉染細胞。功能分析表明L929/GL50基因轉染細胞能夠促進T細胞增殖，并可以顯著地促進T細胞分泌細胞因子IL-10、IL-4和IL-17，而不影響IL-2的

4、分泌。
　　 第二部分功能性鼠抗人GL50單克隆抗體的研制
　　 以L929/GL50為免疫原，免疫Balb/c小鼠，采用經典雜交瘤技術，將免疫后鼠的脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0進行融合并經HAT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)。以L929/GL50細胞作為陽性篩選細胞株，經流式細胞術分析，對抗體分泌陽性孔內細胞反復篩選并經多次的克隆化培養(yǎng)，最終獲得2株穩(wěn)定、持續(xù)分泌鼠抗人GL50單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為2B4、4D1

5、1。這兩株雜交瘤細胞株經體外連續(xù)傳代(50代)培養(yǎng)，在液氮凍存半年后復蘇，仍然生長狀態(tài)良好，分泌抗體性能穩(wěn)定。
　　 采用本科室建立的腹水誘生的方法制備單克隆抗體，腹水的平均產量為3～4ml/只小鼠。經Protein G親和層析柱分離純化，兩株單克隆抗體純化后蛋白濃度在3～4mg/ml之間，間接免疫熒光標記法分析表明，其效價在1:5000以上，用于間接免疫熒光分析時抗體蛋白的用量為0.2～2μg/1×106細胞。單克隆抗體核型分

6、析的結果顯示，兩株雜交瘤2B4與4D11的染色體數(shù)目都超過小鼠B細胞與SP2/0的染色體數(shù)目，約為100條左右，表明這兩株雜交瘤2B4與4D11為融合體。
　　 使用快速定性試紙條鑒定，單克隆抗體2B4與4D11的重鏈分別為IgG1、IgG2a，兩者輕鏈同為κ鏈。流式細胞術，Dot-blot與酶聯(lián)吸附的方法分析表明，單克隆抗體2B4與4D11均能夠與人GL50分子特異性結合?？贵w的抗原表位競爭抑制實驗結果表明，單克隆抗體2B4與