轉(zhuǎn)錄因子Arx的核質(zhì)分布在調(diào)控C2C12細(xì)胞分化中的作用.pdf

1、同源異型蛋白是一類(lèi)含有同源異型結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子,它們控制著許多細(xì)胞過(guò)程,包括細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等,在胚胎發(fā)育中對(duì)組織和器官的形成具有重要的調(diào)控作用。在細(xì)胞核中,同源異型蛋白通過(guò)同源異型結(jié)構(gòu)域組成的α螺旋-轉(zhuǎn)角-α螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)合DNA,從而調(diào)控著下游基因的表達(dá)。
　　肌肉調(diào)節(jié)因子(MRFs)和肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2(MEF2)是骨骼肌發(fā)生中的重要轉(zhuǎn)錄因子。此外同源異型蛋白對(duì)骨骼肌發(fā)生也起著重要的作用。Six1同源異型蛋白在早期肌源細(xì)胞決

2、定、成肌細(xì)胞增殖、肌纖維形成和肌纖維類(lèi)型決定中都起著重要的作用,它能夠結(jié)合肌肉調(diào)節(jié)因子myogenin啟動(dòng)子上的MEF3位點(diǎn),激活轉(zhuǎn)錄,引起成肌細(xì)胞的分化。胚胎期、嬰兒期和成體分離出的成肌細(xì)胞中均能檢測(cè)到同源異型蛋白Arx的表達(dá),但是其在肌分化中的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。
　　本研究應(yīng)用成肌細(xì)胞C2C12體外分化模型,系統(tǒng)研究了同源異型蛋白Arx通過(guò)其核質(zhì)分布的變化調(diào)控SIX1的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)C2C12細(xì)胞分化的分子機(jī)制。通過(guò)異核體細(xì)胞融

3、合實(shí)驗(yàn),我們首次發(fā)現(xiàn)并確定了Arx蛋白是一個(gè)核質(zhì)穿梭蛋白。在缺失突變實(shí)驗(yàn)中,推斷出Arx具有出核功能的酸性氨基酸結(jié)構(gòu)域(a.a.200-250),應(yīng)用蛋白質(zhì)相互作用方法,初步確定了CAS是Arx的出核轉(zhuǎn)運(yùn)受體。同時(shí)我們觀察到內(nèi)源Arx在C21C2細(xì)胞的分化中有出核現(xiàn)象,即未分化細(xì)胞Arx主要分布在細(xì)胞核中,細(xì)胞分化時(shí),Arx主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,而Arx在C2C12分化中的表達(dá)量并沒(méi)有變化。通過(guò)對(duì)Arx可能作用的且與成肌細(xì)胞分化有關(guān)基因的

4、啟動(dòng)子序列分析,我們推測(cè)SIX1基因可能是Arx結(jié)合的靶基因,應(yīng)用熒光素酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn),凝膠遷移實(shí)驗(yàn)和染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),證明Arx可以直接與SIX1啟動(dòng)子結(jié)合,抑制Sixl的表達(dá)。另外我們還發(fā)現(xiàn)在C2C12細(xì)胞中,外源表達(dá)的Arx蛋白能夠通過(guò)抑制Six1的表達(dá)阻止分化,并且Arx在缺失出核信號(hào)的情況下,抑制作用更加明顯。相反,Arx同源異型結(jié)構(gòu)域上382位點(diǎn)突變由于不能與SIX1基因結(jié)合而失去轉(zhuǎn)錄抑制功能,細(xì)胞分化正常進(jìn)行。本研究首