RNA干擾沉默PID1基因在C2C12細胞中表達的研究.pdf

1、隨著人們生活水平的不斷提高，消費者和生產者越來越重視豬肉的品質。衡量豬肉品質的一個重要的指標是肌內脂肪(IMF)的含量，它對肉的嫩度、多汁性和風味有明顯的正效應，目前關于調控豬肌內脂肪沉積的機理還不清楚，主效基因還沒有確定。PID1基因在脂肪細胞增殖中起重要作用，在肥胖人群中呈高豐度表達。本實驗室研究了PID1基因在萊蕪豬、魯萊黑豬、大白豬三個豬種的背膘、背最長肌和肝臟中的表達差異以及與IMF的關系，提示PID1基因可能與IMF的沉積密

2、切相關。本研究通過構建小鼠模型的方式，構建以U6啟動子控制下能產生針對PID1的短發(fā)夾環(huán)狀小干擾RNA表達載體，將干擾載體轉染進C2C12成肌細胞中，采用RT-PCR和Westernblot方法檢測shRNA干擾載體對C2C12細胞中PID1mRNA和蛋白表達的下調作用，為進一步研究驗證PID1基因影響IMF沉積的功能奠定基礎。
　　 為了構建和篩選對小鼠PID1(phosphotyrosineinteractiondomain

3、containing1，PID1)基因RNA干擾的PID1-shRNA表達載體。根據(jù)小鼠PID1cDNA序列，優(yōu)化設計4條shRNA序列以及1條陰性干擾序列，相應的雙鏈DNA被插入pGPU6/GFP/Neo載體中，即pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-D和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-NC。將

4、干擾載體轉染C2C12細胞，采用RT-PCR和Westernblot檢測shRNA對C2C12細胞PID1mRNA和蛋白表達的下調作用。結果表明：靶向PID1基因的4個shRNA重組質粒載體經測序分析，shRNA編碼序列與設計的片段完全一致，經酶切凝膠電泳證實載體構建成功。構建的4個表達載體分別轉染C2C12細胞，24h后細胞中PID1基因mRNA表達水平依次下調(23.58±1.87)％、(75.44±0.77)％、(70.52±0.