Furin對HBcAg的切割及其轉錄調控初探.pdf

1、乙型肝炎在我國是一種高發(fā)疾病，受感染人數達7億以上，其中長期攜帶乙肝病毒表面抗原(HBsAg)者達1.2億人，其危害遠遠超過結核、艾滋病及傳染性非典型肺炎(SARS)等傳染病。在慢性肝炎階段進行抗病毒治療是改善患者預后的重要途徑，但仍存在很多問題，特別是HBeAg(—)CHB，療程長，復發(fā)率高，結局較差。 HBV前C/C基因編碼HBeAg前體(P22等)和HBcAg(P21)，前C—C基因的初始產物為P25，在氨基端比P21多

2、29個氨基酸。進入內質網的P25首先被信號肽酶切去氨基端19個氨基酸而成為HBeAg前體(HBeAg precursor，P22)。P22在經過高爾基體時，部分被人蛋白酶furin切去羧基端的34個氨基酸殘基產生分泌性蛋白HBeAg(P17)，并分泌到細胞外，主要通過誘導免疫耐受而參與慢性HBV感染狀態(tài)的形成和維持。 HBeAg陰性CHB長期預后差，其發(fā)病機理方面尚不清楚，此類患者的HBV多數存在前C或BCP變異，導致HBeA

3、g消失和病毒復制能力的下降。從理論上分析，因HBeAg的免疫耐受作用消失和病毒復制力的下降而使得感染更易被控制。因此，推測HBeAg陰性CHB可能存在一種或一些與HBeAg類似的免疫耐受機制。HBcAg與HBeAg前體有相同羧基端，均具有furin酶切割位點，因而推斷HBcAg也能被furin酶切割，其切割產物(暫命名為“HBfAg”)因與分泌性的HBeAg相似，推測HBfAg在HBeAg陰性CHB中發(fā)揮免疫耐受作用。 Fur

4、具有三個啟動子：P1，P1A，P1B，在肝細胞中，furin P1啟動子對基因轉錄起主要作用，是一個可調型啟動子，具有TATA盒。在其近側區(qū)1168bp的范圍內Genebank已登記了6個SNP，然而，有關這些SNP的功能目前尚無研究報道。課題組前期研究表明，P1啟動區(qū)—229(C/T)的T等位基因和TT基因型與HBV持續(xù)感染顯著相關，表明—229 C/T是功能性SNP，對furin基因轉錄和furin活性水平有實質性影響，進一步采用雙

5、熒光報告系統(tǒng)證實T基因型轉錄活性是C基因型的3倍，基于生物信息學技術，發(fā)現等位基因T增強轉錄因子NF—E2結合基序，推測T等位基因型主要通過NF—E2轉錄因子增強其轉錄水平。本課題分為以下兩部分： 第一部分 Furin體外條件切割HGcAg及其產物在細胞內定位 [目的] 1、應用Western blot驗證furin體外條件下切割HBcAg； 2、觀察P21、HBcAg切割產物(暫命名為HBfAg)在細胞

6、內分布。 [材料和方法] 1、使用重組表達HBcAg及furin，分別在4℃16h、30℃1h、30℃3h條件下反應，產物經Western blot驗證； 2、真核表達載體使用pCI—neo，構建表達P21、羧基端缺失P21(furin切割預期產物)重組體，使用FugeneHD將上述重組體穩(wěn)定轉染HepG2細胞，共聚焦顯微鏡觀察其細胞內定位。 [結果] 1、Western blot顯示HBcAg在

7、furin作用下被切割成大致16 kD的產物； 2、在轉染的細胞內，HBfAg也具有抗原性，能與常用抗—HBc單抗反應，其分布與HBcAg類似。 [結論] 1、在體外，HBcAg可被furin切割； 2、其切割效應，以及產物HBfAg對HBV感染的影響需進一步研究 第二部分 Fur基因P1啟動—229(C/T)基因型轉錄活性差異分子機制研究 [目的] 闡明Fur P1啟動區(qū)—229

8、C/T基因型轉錄活性差異的分子機制。 [材料和方法] 1、采用QuikChange定點突變試劑盒，在原有pGL—229C、pGL—229T重組體基礎上，構建相關堿基突變的突變型pGL—CMI、pGL—CM2、pGL—CM3、pGL—CM4、pGL—TM1、pGL—TM2、pGL—TM3、pGL—TM4(基于生物信息學資料)；其中—CM1、—CM2、—TM1、—TM2為優(yōu)化轉錄因子NF—E2結合基序，—CM3、—TM3為破

9、壞轉錄因子NF—E2結合基序，—CM4、—TM4為破壞CCAAT盒； 2、將上述突變重組體轉染HepG2細胞，使用雙熒光報告系統(tǒng)檢測轉錄活性的改變，各組相對熒光活性比較采用單因素方差分析。 [結果] 1、成功構建pGL—229C、pGL—229T定點突變型，經測序驗證正確； 2、優(yōu)化NF—E2結含基序的pGL—CM1、pGL—CM2的轉錄活性分別是pGL—229C的82％和123％，均為P>0.05；

10、 3、優(yōu)化NF—E2轉錄因子結合序列的pGL—TM1和pGL—TM2轉錄活性分別pGL—229T的9.2倍和15.3倍(P<0.01)； 4、壞NF—E2轉錄因子結合基序的pGL—CM3和pGL—TM3轉錄活性明顯降低。分別是pGL—229C和pGL—229T的43.7％、76.6％，均為P<0.05； 5、破壞CCAAT元件突變型轉錄活性沒有明顯下降(pGL—CM4 vs pGL—229CP=0.089；pGL—T