宮頸癌及其前期病變HPV感染與基因型分布及HPV16癌基因轉(zhuǎn)錄水平沉默的研究.pdf

1、研究背景：　　宮頸癌是女性第二大常見的惡性腫瘤，是嚴重威脅我國女性健康的疾病。在所有惡性腫瘤中，宮頸癌的發(fā)病因素最為明確，高危人乳頭瘤病毒(HPV)感染是關鍵和必要的致病因素。宮頸癌明確的致病因素和緩慢的發(fā)病過程為宮頸癌的防治提供了寶貴時機。 在所有HPV基因型中，目前已明確有15個型與宮頸癌相關，屬于高危型，但仍有多個HPV基因型因感染率較低，其危險度的確定仍有待于進一步的研究。已知HPV基因型分布具有地區(qū)差異，但國內(nèi)HPV

2、基因型分布的數(shù)據(jù)較少，浙江省尚無報道。在HPV基因型的檢測方法上，雖然方法種類多，但仍存在各種問題，如不能區(qū)分具體基因型(如雜交捕獲法)，靈敏度低(southern blot)，覆蓋的基因型較少(PCR-雜交法)，價格昂貴(基因芯片法)等。因此，建立一種合適的HPV基因型檢測方法，檢測并確定來自浙江省的宮頸癌及其前期病變患者感染的主要HPV基因型具有非常重要的意義。 宮頸癌的疫苗已取得了重大進展，但是由于疫苗是通過預防HPV感染

3、進而預防宮頸癌的發(fā)生，而HPV高感染率高自然清除率的特點使價格昂貴的疫苗難以在中國婦女中進行普及。在中國更現(xiàn)實可行的方法是通過治療高危HPV持續(xù)感染來預防宮頸癌的發(fā)生。新興的RNA干擾(RNAi)技術為高危HPV持續(xù)感染癌基因的阻斷治療提供了新的手段。目前RNAi在宮頸癌上的研究基本集中在HPV E6/E7轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。但由于病毒特有變異能力，探索多個途徑基因沉默的研究非常重要。最新研究發(fā)現(xiàn)，RNAi也可在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮作用，與啟

4、動子同源的siRNA可通過DNA甲基化及其他表觀遺傳學機制使下游基因表達沉默。HPV16癌基因E6和E7具有共同的啟動子，為RNAi在轉(zhuǎn)錄水平同時沉默E6和E7轉(zhuǎn)錄提供了可行性，但迄今尚未見利用RNAi對HPV病毒基因在轉(zhuǎn)錄水平沉默的研究報道。由于RNAi轉(zhuǎn)錄水平的作用機制涉及DNA甲基化，因此也有必要了解不同宮頸HPV感染狀態(tài)(HPV感染的宮頸癌及其前期病變、單純感染)下HPV16關鍵調(diào)控區(qū)的DNA甲基化狀態(tài)，探索其在宮頸癌發(fā)生過程中

5、的意義，也有助于為干擾靶點的選擇提供指導價值。因此，本研究擬建立一種覆蓋HPV基因型廣、性價比高的HPV基因型檢測方法，對來自浙江省官頸癌及其癌前病變患者的HPV基因型進行檢測，確定浙江省宮頸癌及其癌前病變患者的主要HPV基因型；對最常見的基因型HPV16，通過宮頸癌及其前期病變和單純感染中HPV16主要調(diào)控區(qū)DNA甲基化的檢測，明確DNA甲基化狀態(tài)在宮頸癌變過程中的意義；在此基礎上，利用小干擾RNA靶向HPV16啟動子區(qū)在轉(zhuǎn)錄水平誘導

6、癌基因E6/E7的基因沉默，以探索HPV16癌基因沉默的新途徑。 第一部分　一種HPV基因型檢測方法的建立 目的： 建立一種生殖道HPV基因型的檢測方法 方法： 針對各生殖道HPV基因型的序列，選擇合適的限制性內(nèi)切酶，設計PCR產(chǎn)物的限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP法)，以雜交捕獲法(HCⅡ)檢驗該方法的敏感性，用測序法檢驗該方法的準確性。 結(jié)果： 建立了一種檢測生殖道H

7、PV基因型的PCR-RFLP法，建立各常見基因型的酶切圖譜。PCR-RFLP和HCⅡ法HPV檢測的符合率為92.4％。PCR-RFLP法判定的HPV基因型均與測序法檢測的結(jié)果一致。 結(jié)論： PCR-RFLP法檢測生殖道HPV感染基因型準確性高、覆蓋基因型廣、性價比好，可用于HPV基因型的檢測。 第二部分　宮頸癌及其前期病變的HPV感染及其基因型分布 目的： 了解來自浙江省的宮頸癌及其前期病變患者的

8、HPV感染及其基因型的分布情況 方法： 以2004年5月至2006年4月間在浙江大學醫(yī)學院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院以官頸疾病就診的患者為研究對象，用PCR-RFLP法檢測HPV基因型的感染情況。共成功檢測了631例官頸癌及其前期病變患者，其中宮頸癌(181例)、CIN Ⅱ-Ⅲ(345例)、CIN Ⅰ(105例)。以217例年齡配對的無細胞學異常者作為對照。 結(jié)果： 宮頸癌中HPV的感染率為95.0％，CIN Ⅱ-Ⅲ

9、中感染率為88.4％，而CINⅠ中的感染率為73.3％。在宮頸癌及其前期病變中共檢測到24型HPV。在宮頸癌中主要的基因型為HPV16，HPV18和HPV58；而在CIN中主要基因型為HPV16，HPV58，HPV33和HPV18。HR-HPV與LR-HPV的比例隨著CIN級別的增加直至宮頸癌逐漸增加。HPV16的構(gòu)成比亦隨CIN級別的增加直至宮頸癌逐漸增加。 結(jié)論： 1.宮頸癌HPV的感染率為95.0％，CIN Ⅱ-Ⅲ

10、 88.4％，CIN Ⅰ 73.3％提示浙江省宮頸癌及其前期病變的HPV感染率高于中國其他地區(qū)。 2.宮頸癌主要的基因型為HPV16，HPV58，HPV18，CIN主要的基因型為HPV16，HPV58，HPV33和HPV18，提示除HPV16和18以外，浙江省宮頸癌及其前期病變的主要基因型為HPV58，可能也包括HPV33。 第三部分　宮頸癌及其前期病變和單純感染中HPV 16長控制區(qū)的甲基化檢測 目的：

11、 獲得HPV16 LCR關鍵區(qū)域的詳細甲基化信息，探索HPV16 LCR區(qū)甲基化在不同宮頸HPVl6感染狀態(tài)中的意義。 方法： 采用亞硫酸氫修飾后焦磷酸測序法，檢測了70例臨床宮頸標本的HPV16的甲基化狀態(tài)，包括26例宮頸癌，13例高度宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN Ⅲ)，17例中低度官頸上皮內(nèi)瘤變(CIN Ⅰ-Ⅱ)和14例單純感染者。 結(jié)果： HPV16 LCR總體甲基化狀態(tài)顯示官頸癌和HPV16單純感染中H

12、PV16LCR區(qū)的甲基化相對多見。HPV16LCR關鍵區(qū)域八個CpG位點的詳細甲基化狀態(tài)顯示啟動子區(qū)的甲基化較增強子多見。 結(jié)論： 1.與單純感染相比，CIN中HPV16 LCR呈去甲基化狀態(tài)，提示LCR去甲基化與宮頸瘤變的起始階段相關。 2.在宮頸癌中HPV16 LCR呈相對高甲基化，可能是宿主細胞防御病毒癌基因表達的反映。 3.HPV16 LCR啟動子區(qū)的甲基化檢出率和CpG位點的甲基化頻率高于增強子

13、區(qū)，提示啟動子區(qū)甲基化在調(diào)節(jié)病毒基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮更重要作用。 第四部分　siRNA靶向HPV16啟動子區(qū)誘導癌基因E6/E7的基因沉默 目的： 探索HPV16癌基因在轉(zhuǎn)錄水平沉默的途徑方法：設計靶向HPV16 E6/E7啟動子區(qū)的siRNA，并將siRNA轉(zhuǎn)染入宮頸癌細胞株SiHa中，觀察癌基因E6和E7的表達情況，細胞的生長、增殖和凋亡情況，以及HPV16啟動子區(qū)的DNA甲基化情況。 結(jié)果： E6