miR-21調(diào)控TGF-β通路促進(jìn)增生性瘢痕形成的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　創(chuàng)傷后增生性瘢痕（HS）是困擾臨床的關(guān)鍵問題之一，其本質(zhì)是一種纖維化疾病。但具體調(diào)控機(jī)制不詳。通過對(duì)多種纖維化疾病的研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在轉(zhuǎn)錄后水平通過調(diào)控TGF-β和Smad7基因的表達(dá)，對(duì)纖維化的發(fā)生起促進(jìn)作用。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn) HS組織中 miR-21表達(dá)顯著升高，并在預(yù)實(shí)驗(yàn)中觀察到 TGF-β促進(jìn)miR-21的表達(dá)。我們推測(cè)“皮膚創(chuàng)傷愈合后局部miR-21表達(dá)升高，促進(jìn)了TGF-β的表達(dá)，而TGF-β進(jìn)

2、一步加強(qiáng)了miR-21對(duì)瘢痕形成的促進(jìn)作用，從而形成正反饋，導(dǎo)致HS的形成”是瘢痕增生的新機(jī)制。為證實(shí)這一假說，我們擬以成纖維細(xì)胞（正常皮膚和HS組織）和瘢痕模型為研究對(duì)象，應(yīng)用real-time PCR、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、anti-miR、免疫組化等技術(shù)，從細(xì)胞（體外）-組織（體內(nèi)）層次證明我們的假說。此研究有望深入闡明miR-21在HS形成中的作用及機(jī)制，并為HS的生物學(xué)防治提供新靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1、包括臨床患者正常皮膚

3、及HS標(biāo)本收集；組織石蠟包埋，切片進(jìn)行HE染色、馬森三色染色和免疫組化染色；組織進(jìn)行膠原定量檢測(cè)；real-time PCR檢測(cè)人正常皮膚組織及臨床HS組織中miR-21 mRNA表達(dá)水平差異；
　　2、進(jìn)行人正常皮膚成纖維細(xì)胞和 HS成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染；構(gòu)建 miR-21過表達(dá)和反義干擾載體，定量PCR、WB檢測(cè)COLI、COL III、Fibronectin（FN）及α-SMA，從而觀察miR-21對(duì)成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性的

4、影響。
　　3、轉(zhuǎn)染mimic-miR-21或anti-miR-21，同時(shí)加入TGF-β1或TGF-β1受體抑制劑，定量PCR、ELISA檢測(cè)TGF-β1及瘢痕相關(guān)蛋白的表達(dá)；從而明確miR-21影響瘢痕形成是否與TGF-β通路有關(guān)；
　　4、通過多個(gè)生物信息學(xué)網(wǎng)站和軟件（Targetscan, PicTar, miRanda及MicroInspector），對(duì)miR-21的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，篩選與瘢痕形成、肌成纖維分化等功能

5、相關(guān)的特定靶基因；使用 miR-21過表達(dá)載體及反義表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)染人正常皮膚成纖維細(xì)胞和 HS成纖維細(xì)胞，采用 qRT-PCR、Western-Blot觀察miR-21對(duì)特定靶基因表達(dá)的調(diào)控作用；
　　結(jié)果：
　　增生性瘢痕中膠原的含量高于正常皮膚；細(xì)胞外基質(zhì)如 COLI、COL III、Fibronectin（FN）及α-SMA在瘢痕中的表達(dá)量高；HS組織中miR-21表達(dá)明顯升高，瘢痕成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti-miR-

6、21可明顯減少瘢痕相關(guān)基因的表達(dá)（FN， collagen，α-SMA）；HS組織中高表達(dá)的TGF-β1，可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其合成膠原等ECM；TGF-β增強(qiáng)HS組織的成纖維細(xì)胞中mir-21的表達(dá)，而抑制mir-21后，TGF-β的促纖維化活性降低；MIR-21抑制其靶基因Smad7的表達(dá)；
　　結(jié)論：
　　1、與正常皮膚相比較，增生性瘢痕（HS）中有miR-21的高表達(dá)；
　　2、miR-21通過在轉(zhuǎn)錄