微孢子蟲感染誘導的家蠶應答反應及對其免疫信號通路的激活.pdf

1、宿主-病原體之間的相互作用非常復雜，近年來對宿主與病原體之間相互作用的研究已經成為熱點。家蠶微孢子蟲N. bombycis是一種主要的家蠶病原體，其引起的家蠶微粒子病會給蠶業(yè)生產帶來重大損失。對家蠶對微孢子蟲侵染的應答反應和兩者之間相互作用的深入了解，有助于微粒子病的防治和治療。在昆蟲中，中腸是消化和攝食營養(yǎng)的重要器官，同時也作為抵抗病原體入侵的第一道防線，因此，中腸是研究微孢子蟲及其宿主-家蠶相互作用的理想模型。本研究建立了微孢子蟲感

2、染的家蠶BmN細胞體系，對微孢子蟲在細胞內的增殖進行了觀察研究，利用 illumina基因組測序分析平臺對攝食感染微孢子蟲后6、12、18、24、48、72和96 h的家蠶中腸表達譜數據進行分析。同時，利用熒光定量PCR技術測定了微孢子蟲感染后，家蠶免疫系統(tǒng)中參與信號識別和信號轉導的相關蛋白的基因轉錄水平。
　　1.家蠶微孢子蟲體外感染增殖體系的建立。通過堿處理法誘導家蠶微孢子蟲發(fā)芽，并利用家蠶 BmN細胞系進行接種培養(yǎng)。觀察其增

3、殖發(fā)現，微孢子蟲在宿主細胞中的發(fā)育是一個逐漸變化的過程。隨著微孢子蟲的不斷增殖，占領宿主細胞質空間并裂解宿主細胞，釋放出來的微孢子蟲對周圍細胞進行侵染，最終占領整個培養(yǎng)空間。該體系的建立為家蠶微孢子蟲基因組學、蛋白質組學的研究打下了基礎。
　　2.微孢子蟲感染引起的家蠶應答反應。通過對微孢子蟲感染后的家蠶中腸進行的數字基因表達譜研究，共得到1902個差異表達基因，包括1168個上調表達的基因和734個下調表達的基因。而且在微孢子蟲

4、感染的不同時期，差異表達基因的個數處于動態(tài)變化之中，并且與微孢子蟲在宿主體內的的增殖呈一定的相關性；對不同時間段的差異基因進行聚類分析結果表明，在5個時間點都發(fā)生差異表達的基因只有3個；在6 h、24 h、48 h和96 h4個時間點都差異表達的基因有7個，在這些基因中，多數都與家蠶的生理代謝相關并呈現下調表達；對差異基因進行的GO富集分析結果顯示：微孢子蟲感染的不同時期，不同功能的蛋白表達差異較大，早期主要為參與家蠶正常代謝和蛋白功能

5、相關的蛋白，后期則為細胞組成相關蛋白基因的差異表達；KEGG富集分析鑒定出出Lysine degradation、SNARE interactions in vesicular transport、Folate biosynthesis等24條顯著差異的代謝途徑，表明微孢子蟲侵染對家蠶葉酸合成、剪接體、煙酸和煙酰酸代謝、自噬等代謝途徑有很大影響。此外，數字基因表達譜還鑒定出一些參與家蠶先天性免疫的一些基因。
　　3.微孢子蟲感染對

6、家蠶免疫信號通路的激活。通過熒光定量 PCR的方法，對微孢子蟲感染家蠶后家蠶免疫系統(tǒng)中信號識別和信號轉導相關基因的進行了表達譜分析，結果表明：家蠶信號識別相關的基因BGRP1-4、PGRP，CTL-5，GNBP等都有顯著的上調表達，表明家蠶對微孢子蟲的侵染具有有效的識別效果；多數參與 Imd、Toll和JAK-STAT信號轉導途徑的基因也有相應的表達變化，表明微孢子蟲的侵染激活了家蠶先天性免疫的信號轉導途徑，最終引起相關免疫效應因子的轉