喹賽多藥理與毒理活性成分篩選研究.pdf

1、喹賽多作為一種新型的飼料添加劑具有良好的促生長(zhǎng)作用，與喹嗯啉類其它藥物相比，喹賽多毒性作用很低。喹賽多在體內(nèi)可被代謝成多種化合物，其中主要代謝物有cy1、cy4、cy6、cy12。迄今為止，仍然不明確喹賽多與代謝物的活性大小。所以有必要對(duì)喹賽多及其代謝物的活性大小進(jìn)行比較，進(jìn)而篩選出活性化合物，這對(duì)理解喹賽多的藥理與毒理作用機(jī)理具有重要的意義。
　　 藥物活性化合物篩選指標(biāo)的選擇成為實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，通過文獻(xiàn)調(diào)研并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室對(duì)喹賽多

2、的實(shí)際研究進(jìn)展情況，最終確定以EGF mRNA的表達(dá)作為喹賽多藥理活性成分篩選的指標(biāo);以化合物與細(xì)胞孵育后對(duì)細(xì)胞活力的影響作為喹賽多毒理活性成分的指標(biāo)。
　　 1、喹賽多的藥理活性成分篩選。
　　 采用RT-qPCR技術(shù)，首先測(cè)定不同濃度的喹賽多與細(xì)胞孵育不同時(shí)間后EGF的表達(dá)，以篩選出喹賽多與細(xì)胞作用后EGF mRNA上調(diào)表達(dá)的最佳濃度與時(shí)間點(diǎn)。結(jié)果顯示，2μM喹賽多與細(xì)胞孵育1h后EGF mRNA的表達(dá)量與空白組相比

3、上調(diào)2倍。喹賽多代謝物與細(xì)胞孵育后EGF mRNA上調(diào)倍數(shù)不如喹賽多顯著，在所有代謝物中cy12對(duì)EGF的上調(diào)作用最明顯，達(dá)到了1.3倍，cy6其次，cy1最低。所以得出喹賽多及其代謝物藥理活性大小順序?yàn)?喹賽多、cy12、cy6、cy4、cy1。加入PI3K和Akt抑制劑后，EGF mRNA表達(dá)量有所下調(diào)，這說明EGF mRNA的表達(dá)受PI3K-Akt調(diào)控。與PI3K相比，Akt對(duì)EGF mRNA表達(dá)的影響更顯著。2μM喹賽多可上調(diào)F

4、OXO1和p53的表達(dá)，但上調(diào)倍數(shù)不明顯。當(dāng)Akt受抑制后，F(xiàn)OXO1的表達(dá)顯著上調(diào)，同時(shí)p53表達(dá)顯著下調(diào);當(dāng)PI3K受抑制后FOXO1和p53表達(dá)變化均沒有抑制Akt后的變化顯著，這提示喹賽多激活的是Akt而不是PI3K。當(dāng)加入ROS清除劑NAC后，喹賽多并不能使FOXO1和p53的表達(dá)發(fā)生顯著變化，這提示喹賽多可能通過代謝產(chǎn)生ROS從而激活A(yù)kt，喹賽多及其代謝物與細(xì)胞孵育后對(duì)Akt磷酸化水平測(cè)定結(jié)果顯示，喹賽多與其代謝物相比可明

5、顯促進(jìn)p-Akt的表達(dá)。
　　 構(gòu)效關(guān)系分析顯示，喹賽多N-O基團(tuán)是喹賽多的活性基團(tuán)，N-O基團(tuán)的代謝決定著喹賽多的活性。N-O基團(tuán)的代謝促進(jìn)細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，2μM喹賽多與細(xì)胞孵育后，ROS在15min左右即開始釋放增加，在60min左右釋放量達(dá)到最高。對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1進(jìn)行熒光定量測(cè)定顯示，喹賽多在2h左右即可引起cyclin D1表達(dá)上調(diào)，在8h左右上調(diào)倍數(shù)達(dá)到最大，western blot檢測(cè)結(jié)果顯示c

6、yclin D1在8h和12h表達(dá)量明顯升高。
　　 由以上結(jié)果我們推測(cè)，喹賽多可代謝產(chǎn)生ROS激活A(yù)kt，上調(diào)EGF的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，達(dá)到促生長(zhǎng)效果。
　　 2、喹賽多毒理活性成分篩選。
　　 MTT實(shí)驗(yàn)與LDH釋放檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，100μM喹賽多及其代謝物均可產(chǎn)生較明顯的細(xì)胞毒性，喹賽多的細(xì)胞毒性明顯高于代謝物，以細(xì)胞毒性大小為指標(biāo)確定喹賽多及其代謝物毒性大小順序?yàn)?

7、喹賽多、cy12、cy4、cy6、cy1，這提示喹賽多經(jīng)代謝后毒性降低。熒光定量結(jié)果顯示，EGF、FOXO1和p53的表達(dá)呈現(xiàn)很明顯的量效關(guān)系，EGF和FOXO1的表達(dá)隨著喹賽多濃度的增加而下降;p53的表達(dá)隨著喹賽多濃度的增加而上升。當(dāng)Akt被抑制后，p53的表達(dá)顯著下調(diào)，F(xiàn)OXO1表達(dá)與空白組相比無明顯變化;當(dāng)PI3K被抑制后，p53和FOXO1的變化沒有Akt抑制后的變化顯著。這提示毒理濃度下喹賽多使Akt而不是PI3K被過度激活

8、，western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，喹賽多與Akt抑制劑共同孵育后，細(xì)胞p-Akt水平較高。
　　 毒理濃度下細(xì)胞ROS釋放測(cè)定結(jié)果顯示，喹賽多與其代謝物相比能明顯促進(jìn)細(xì)胞ROS產(chǎn)生，20μM喹賽多即可顯著促進(jìn)ROS釋放，且量效關(guān)系明顯。時(shí)效關(guān)系測(cè)定顯示，ROS釋放量隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，在90min時(shí)ROS釋放量達(dá)到最高，100μM喹賽多與其代謝物相比可明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　 綜上所述，本研究選用了合適的指標(biāo)

9、，分析了篩選指標(biāo)的時(shí)效量效關(guān)系，比較了喹賽多及其代謝物的活性大小，最終確定N-O基團(tuán)是喹賽多的活性基團(tuán)，喹賽多的藥理與毒理活性高于代謝物，喹賽多代謝產(chǎn)生ROS劑量大小決定喹賽多活性，低劑量喹賽多濃度下，喹賽多代謝產(chǎn)生少量ROS，Akt被輕微激活，細(xì)胞氧化磷酸化作用加快，細(xì)胞分裂加快，喹賽多表現(xiàn)出促生長(zhǎng)效應(yīng);高劑量喹賽多濃度下，喹賽多代謝產(chǎn)生大量ROS，Akt被過度激活，過度激活的Akt一方面使細(xì)胞線粒體負(fù)荷加重促使細(xì)胞產(chǎn)生更多ROS，另