紅麻花藥和花瓣抑制消減雜交文庫的構建及EST序列的分析.pdf

1、紅麻(Kenaf)是錦葵科（Malvaceae）木槿屬（Hibiscus）一年生韌皮纖維作物，學名為Hibiscus cannabinusL.，別名為洋麻、槿麻，是重要的麻紡和造紙原料。本研究以周瑞陽教授選育的紅麻P3B的花藥和花瓣為材料，進行花藥抑制消減雜交文庫構建，得到以下結果:
　　 (1)成功從紅麻花藥和花瓣中提取了高質量的總RNA。
　　 (2)從總RNA中抽提純化到高質量無降解的mRNA，并以2μg mRNA

2、為起始材料成功構建了差減文庫，通過雜交效率檢測證明差減效果較好。將第二次PCR產物收集純化后，連接轉化大腸桿菌，隨機挑取正向文庫和反向文庫各1440個克隆至96孔細菌培養(yǎng)板培養(yǎng)，菌液PCR檢測，挑選條帶單一，大小在200～750bp的克隆測序。初步挑選正向克隆500個測序，除去非單克隆和高級結構，得到有效序列442條。
　　 (3)將測得的442條序列去除載體、接頭以及小于100bp的短片段后，進行聚類分析，共得到150個Clu

3、ster，將有重疊片段(overlapping)的EST序列進行比對拼接得到150個Unigene。將150條Unigene序列同nt非冗余核酸數(shù)據(jù)庫比對，得到已知同源基因77條，占51.33％;未比對上的序列有49條序列，占32.67％，可能為新基因;預測的同源基因有24條，占16％;同nr非冗余蛋白質數(shù)據(jù)庫比對，有功能注釋的序列有78條，占52％;未知功能序列有15條，占10％;預測功能的序列有57條，占38％。
　　 (4

4、)根據(jù)比對結果，進一步將這些序列進行GO功能注釋和COG蛋白質功能預測，按細胞組分分類:細胞(14個unigene)，細胞器(6個unigene)，蛋白質復合體（4個unigene）;按分子功能分類統(tǒng)計:結合功能(35個unigene)，催化活性(59個unigene)，營養(yǎng)庫活性（1個unigene），結構分子活性(2個unigene)，轉錄調節(jié)因子活性（3個unigene），轉運活性（12個unigene）;按生物學過程統(tǒng)計為:細胞

5、內過程(29個unigene)，生理過程（56個unigene），生物學過程調控(3個unigene)。按COG庫中分類文件將這些功能蛋白分為11類:與胞內轉運，分泌及膜泡運輸?shù)南嚓P序列占3.33％，與次級代謝產物的生物合成、運輸和分解過程的相關序列占10％，與翻譯、核糖體結構和生物轉化的相關序列占6.67％，與翻譯后修飾，蛋白質折疊，分子伴侶相關的序列占6.67％，與能量生產和轉化相關的序列占16.67％;與染色質結構和動力學相關的序

6、列占3.33％;與碳水化合物運輸和代謝相關的序列占10％;與無機離子運輸和代謝相關的序列占3.33％;預測的功能蛋白序列占6.67％;與脂質運輸和代謝相關的序列占30％;與轉錄反應相關的序列占3.33％。
　　 (5)通過對比對的結果分析，這些EST序列中，絕大部分編碼的基因產物都和代謝有關，特別是一些水解酶，蛋白激酶，氧化還原酶系統(tǒng)等。同時，還有一些功能蛋白如電子載體，離子結合蛋白，水通道蛋白以及Ca2+結合蛋白等。這些蛋白都

7、是與呼吸，跨膜運輸以及信號轉導緊密相關，說明此時的花藥新陳代謝旺盛，這與所取花藥所處的發(fā)育時期是相關聯(lián)的。
　　 (6)通過對蛋白質的功能注釋和代謝路徑分析，發(fā)現(xiàn)一些EST序列可能與花藥組織特異性表達相關。contig6、contig16、contig24和Z7-F5與查爾酮合酶有關，Z1-G9和Z7-F2與MADS-box轉錄因子有關。
　　 (7)通過對選定的8個unigene進行半定量分析，結果發(fā)現(xiàn)有6個unige