無乳鏈球菌魚源株的免疫原性蛋白篩選和比較基因組學分析.pdf

1、無乳鏈球菌（Streptococcusagalactiae）是革蘭陽性，β溶血的鏈狀球菌。因其蘭氏分群為B群，人醫(yī)臨床常以B群鏈球菌相稱(groupBstreptococci，GBS)。該菌的感染譜較廣，不僅可引起人類新生兒敗血癥和腦膜炎，也是牛乳腺炎的主要病原之一。同時，發(fā)現(xiàn)該菌還可感染魚類并導致其發(fā)病死亡。2009年以來，我國南方羅非魚主養(yǎng)殖區(qū)每年夏季均暴發(fā)無乳鏈球菌病，死亡率高，造成嚴重的經濟損失。如何防控我國的羅非魚無乳鏈球菌病

2、?不同宿主來源的無乳鏈球菌之間存在何種關系?能否將無乳鏈球菌視為一種人、哺乳動物和魚類的共患病病原?均為研究的熱點問題。對我國無乳鏈球菌魚源株進行免疫原性蛋白的篩選和基因組學分析，具有重要的理論意義及應用前景。
　　1.無乳鏈球茸魚源株的分離與毒力分析
　　在分離、鑒定病原菌的基礎上進行特性分析。2010年夏季，從廣東5個羅非魚養(yǎng)殖場中分離到20株具有β溶血、革蘭陽性的鏈狀球菌。經PCR檢測和16SrDNA測序比對，確定均為

3、無乳鏈球菌，且血清型和MLST分型均為Ia，ST-7型。以斑馬魚作為實驗動物，測定細菌毒力，分離株的LD50分布在102至104cfu之間，以分離株GD201008-001的毒力最強，LD50為2.3×102cfu，該菌株將作為后續(xù)研究的代表菌株。試驗還發(fā)現(xiàn)魚源分離株GD201008-001對ICR小鼠的致病力極強，1×101cfu攻毒劑量腹腔注射可引起小鼠腦炎并導致80％的接種動物在24小時內死亡，說明小鼠對該菌株極其敏感。提示無乳鏈

4、球菌魚源株存在感染人和哺乳動物的可能性。
　　2.無乳鏈球菌魚源株免疫原性蛋白的篩選
　　免疫蛋白質組學能快速、準確、高效地鑒定免疫反應性蛋白抗原，是篩選亞單位疫苗候選的首選方法之一。采用免疫蛋白組學方法，以分離株GD201008-001兔高免血清、豚鼠康復血清和羅非魚抗血清作為一抗，分別與轉印在PVDF膜上的魚源株GD201008-001全茵蛋白作用，篩選無乳鏈球菌在不同狀態(tài)，不同宿主環(huán)境下的免疫反應性抗原。共鑒定18個蛋

5、白，其中已報道的無乳鏈球菌免疫保護性蛋白有:磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)，菌毛骨架蛋白(BP-2b)，磷酸甘油酸激酶(phosphoglyceratekinase)。此外，發(fā)現(xiàn)了7個新的免疫反應性的蛋白。選擇免疫反應性強的8個候選蛋白進行原核表達及免疫轉印，發(fā)現(xiàn)其中的3個蛋白:支鏈a酮酸脫氫酶E2亞單位（branched-chainalpha-ketoaciddehydrogenasesubunitE2），5'核苷酸酶家族蛋白（5'-

6、nucleotidasefamilyprotein）以及氨甲酰基轉移酶（ornithinecarbamoyltransferase）均可被兔高免血清、豚鼠康復血清和羅非魚抗血清識別，表明這些蛋白在無乳鏈球菌魚源株感染哺乳動物和魚類的過程中，均與機體的免疫系統(tǒng)發(fā)生反應，刺激機體產生相應抗體，可作為候選的免疫保護性抗原。這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)無乳鏈球菌魚源株亞單位疫苗的研發(fā)提供了基礎。
　　3.鏈球菌表面蛋白篩選新方法的建立及在無乳鏈球菌中的

7、應用
　　細菌的表面蛋白直接與宿主的免疫系統(tǒng)接觸，往往是致病機理中重要的抗原或毒力因子，也是亞單位疫苗的候選物。借鑒免疫學中經典的交叉吸附方法，用高免血清與對應細菌進行混合吸附，獲得吸附血清。將吸附血清和未吸附的高免血清分別用于免疫蛋白組學試驗，比較兩者免疫轉印結果的差異，建立了一種篩選細菌表面蛋白的新方法:預吸附免疫蛋白組學方法(pre-absorbedimmunoproteomicsmethod，PAIM)。用此方法篩選到無乳

8、鏈球菌魚源株GD201008-001的一個表面蛋白，命名為XF。將該蛋白進行原核表達和免疫轉印，發(fā)現(xiàn)其免疫反應性強，可被豚鼠康復血清和羅非魚抗血清識別。說明預吸附免疫蛋白組學方法是一種行之有效的篩選細菌表面蛋白的方法，經其篩選到的表面蛋白XF是一種潛在的免疫保護性抗原，可作為亞單位疫苗的候選分子。
　　4.無乳鏈球菌魚源株GD201008-001的xf基因缺失株構建及特性分析
　　為進一步研究PAIM試驗篩選到的無乳鏈球菌魚

9、源株GD201008-001表面蛋白XF的功能，利用鏈球菌-大腸桿菌穿梭質粒pSET4S和pSET2，通過同源重組的方法構建了xf基因的缺失株△XF與互補株C△XF。生物特性分析表明，xf基因的缺失株與互補株的遺傳穩(wěn)定性較好，在細菌染色形態(tài)上與野生株無差異，生長速度略慢于野生株。三者對HEp-2細胞的粘附均不明顯，且缺失株與野生株相比無明顯差異。但是缺失株△XF對斑馬魚的毒力有明顯下降，LD50上升4倍。說明XF蛋白參與了魚源株GD20

10、1008-001對斑馬魚的致病過程，是一種與毒力相關的蛋白。
　　5.無乳鏈球茵魚源株GD201008-001全基因組測序及比較基因組學分析
　　借助成熟的Roche454和IlluminaSolexa測序技術，通過序列拼接和補洞，完成了魚源分離株GD201008-001的全基因組測序，在NCBI的基因組登錄號為NC_018646。GD201008-001基因組大小2.1Mb，編碼1964個蛋白，擁有7個rRNA和77個tR

11、NA，它的基本特征和CRISPR、前噬菌體、毒力基因的分布，與另一株中國魚源株ZQ0910以及人源株A909基因組最為相似。對不同宿主來源的15株無乳鏈球菌的基因組進行比較基因組學分析發(fā)現(xiàn):在15株無乳鏈球菌中均保守存在的基因，即核心基因為1202個，有2040個基因是各菌株特有的基因，擬合曲線顯示無乳鏈球菌泛基因組為開放型，說明在該細菌種內即便有數(shù)以千計的基因組被測序，還是會有新的基因出現(xiàn)。系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，中國魚源分離株GD20100

12、8-001、ZQ0910基因組與人源株A909屬于同一分支，進化關系最近，提示可能來源同一祖先。研究還發(fā)現(xiàn)，有一段10kb的特有基因序列只存在于中國魚源株GD201008-001和ZQ0910的基因組中，含有12個ORF。這段特有序列與咽峽炎鏈球菌（S.anginosus）SK52=DSM20563菌株的基因組序列最為相似。其中一個ORF(A964_1958)注釋為LPXTG膜錨定蛋白。將A964_1958進行原核表達和免疫轉印，發(fā)現(xiàn)它