魚源無乳鏈球菌感染小鼠巨噬細胞差異轉錄基因的篩選及功能研究.pdf

1、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae），亦稱B群鏈球菌(Group B Streptococcus，GBS)，具有廣泛的宿主感染范圍，可引起新生兒敗血癥、肺炎和腦膜炎，奶牛乳腺炎及魚類腦膜炎。近年來，無乳鏈球菌對魚類危害嚴重，已引起廣泛重視，但其致病機制尚不明確。本研究在比較魚源、牛源、人源無乳鏈球菌毒力的基礎上，利用選擇性捕獲轉錄序列(SCOTS)技術篩選了魚源無乳鏈球菌感染小鼠巨噬細胞差異轉錄的基因，并對其中

2、轉錄上調的aroA、dlpE、msrB及pulA等基因的功能進行了鑒定，對aroA缺失株作為弱毒疫苗免疫小鼠的保護效果進行了探討，研究結果為闡明無乳鏈球菌的致病機制提供了理論基礎，同時也具有潛在的應用前景。
　　1.無乳鏈球菌與巨噬細胞和腦微血管內皮細胞的相互作用
　　以小鼠巨噬細胞RAW264.7和腦微血管內皮細胞bEnd.3為體外研究模型，探討魚源無乳鏈球菌GD201008-001與細胞的互作。結果顯示，無乳鏈球菌可以被

3、巨噬細胞吞噬，吞噬數(shù)量與細菌濃度呈正相關。通過比較魚源、牛源、人源三株無乳鏈球菌的抗吞噬能力、巨噬細胞內存活能力及對RAW264.7和bEnd.3的毒性發(fā)現(xiàn):魚源株GD201008-001的抗吞噬能力顯著高于牛源和人源株(P＜0.05），吞噬率分別為12.77％、28.48％和32.58％;3株無乳鏈球菌均可在巨噬細胞內存活超過24h，在感染巨噬細胞24h時的存活率分別為16.18％、6.00％和94.87％; GD201008-001

4、對RAW264.7和bEnd.3的毒性水平也顯著高于牛源和人源株(P＜0.05)。說明魚源株GD201008-001的毒力強于牛源株和人源株。
　　2.SCOTS篩選魚源無乳鏈球菌感染小鼠巨噬細胞差異轉錄基因
　　利用選擇性捕獲轉錄序列(SCOTS)的方法，研究無乳鏈球菌在巨噬細胞內存活相關基因的轉錄情況。結果共篩選到60個基因，分為7大類:9個基因與細菌細胞壁和外膜的合成相關，主要參與肽聚糖和外膜蛋白的合成;32個基因與代

5、謝和應激反應相關，參與糖類、脂類、蛋白質及核酸的代謝;5個基因與細胞分裂和核酸的損傷修復相關;4個基因與轉運功能相關，包括ABC轉運子和氯離子通道蛋白;4個基因與轉錄調節(jié)相關;2個基因與蛋白分選相關，包括分子伴侶和信號肽;4個基因功能未知。其中，50％以上的上調基因參與了代謝和適應反應，部分基因在其它細菌的研究中已被證明與毒力相關。該試驗結果為揭示無乳鏈球菌在巨噬細胞內存活及其感染的分子機制奠定了基礎。
　　3.差異轉錄基因缺失株

6、和互補株的構建
　　針對SCOTS技術篩選到的GD201008-001在巨噬細胞中存活上調表達的aroA、clpE、msrB和pulA基因，為探討其功能，采用同源重組技術，利用溫敏型鏈球菌-大腸桿菌穿梭質粒pSET4s和pSET2質粒，分別構建了4種基因的缺失株和相應的互補株。經(jīng)過PCR鑒定、基因測序和實時定量PCR在mRNA轉錄水平上的檢測，證明缺失株與互補株構建成功，遺傳穩(wěn)定性良好。與野生株GD201008-001相比，各缺失

7、株與互補株在細菌形態(tài)染色上無明顯差異，ΔpulA生長速度明顯低于野生株，其它各菌株的生長速度與野生株無明顯差異。
　　4.無乳鏈球菌感染小鼠巨噬細胞差異轉錄基因缺失株的生物學特性分析
　　對aroA、clpE、msrB、pulA基因缺失株，開展了巨噬細胞吞噬及胞內存活能力，對酸性及氧化應激環(huán)境的耐受能力，對小鼠微腦血管內皮細胞的黏附能力，對小鼠巨噬細胞和腦微血管內皮細胞的毒性作用，對斑馬魚及小鼠半數(shù)致死量，小鼠組織細菌載量，

8、以及巨噬細胞和小鼠早期促炎細胞因子表達能力的分析。結果表明，clpE缺失株被巨噬細胞吞噬的效率顯著升高。aroA、clpE、msrB基因缺失株在巨噬細胞中的存活能力有不同程度的降低，并且對體外模擬的氧化環(huán)境的耐受能力顯著降低。clpE、msrB基因缺失株對酸性環(huán)境的耐受能力也顯著降低。aroA、clpE、pulA基因缺失株對小鼠腦微血管內皮細胞的黏附能力顯著降低，對巨噬細胞和腦微血管內皮細胞的毒性作用也顯著下降。在動物感染試驗中，aro

9、A基因缺失株對斑馬魚和小鼠的LD50顯著提高，與野生株相比，分別增加了1.84×103和1.56×106倍。clpE、msrB、pulA基因缺失株對斑馬魚LD50有所升高，對小鼠的LD50無明顯變化，但是小鼠的死亡時間有所滯后。aroA、clpE、pulA基因缺失之后，缺失株在小鼠感染后16h時，小鼠血液、脾臟和腦的細菌載量顯著降低，而msrB基因缺失株僅在小鼠腦組織的載量顯著下降。此外，aroA基因缺失株感染巨噬細胞后，引起巨噬細胞早

10、期促炎細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平上調倍數(shù)顯著高于野生株，而其它基因缺失株這三個細胞因子的轉錄水平則與野生株相當。在體內試驗中，aroA基因缺失株感染小鼠后16h內，IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA轉錄一直處于較低水平且無明顯變化，而野生株感染小鼠，這三個細胞因子mRNA轉錄呈持續(xù)增長的趨勢，且在感染后期顯著高于aroA基因缺失株。
　　5.無乳鏈球菌aroA缺失株小鼠免疫效果評價
　　以

11、無乳鏈球菌aroA基因缺失株作為弱毒苗，并與全菌滅活苗相比，對小鼠的免疫效果進行評價。研究發(fā)現(xiàn)，單次免疫101～103CFU缺失株對小鼠均具一定的的免疫保護效果。當缺失株免疫劑量為103CFU/只時，免疫小鼠對104CFU(＞1000 LD50)野生株攻毒的相對保護率為90％。弱毒苗及滅活苗免疫組小鼠均會產生高水平的IgG抗體，且弱毒苗免疫組抗體水平高于滅活苗免疫組。同樣，兩種疫苗均可引起小鼠脾臟淋巴細胞CD4+和CD8+細胞的比率升高