蘇云金芽孢桿菌vip3A基因及殺蟲防病工程菌研究.pdf

1、營養(yǎng)期殺蟲蛋白(vegetativeinsecticidal proteins,VIPs)是蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thruingiensis,Bt)在對數(shù)生長中期分泌的一類新型殺蟲毒蛋白,它對鱗翅目昆蟲具有較廣譜的殺蟲活性.Vip3A蛋白通過誘發(fā)細胞凋亡,最終導致昆蟲死亡,這種作用機理與Bt殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal proteins,ICPs)的作用機理完全不同.該文對實驗室保存的菌株進行vip

2、3A基因的檢測,克隆了vip3A-WB5基因并在大腸桿菌中得到高效表達.應用生物信息學對vip3A-WB5基因的序列進行了分析.將vip3A-WB5基因導入具有防病、內生和促生功能的野生枯草芽孢桿菌中,構建了多功能工程菌.用PCR方法對該室保存的菌株篩選獲得30株含有vip3A基因.從中挑選對夜蛾科(Noctuidae)害蟲具有較高毒力的WB5菌株,進行vip3A基因的克隆和測序.將克隆的vip3A-WB5基因插入表達載體pET29a(

3、+),構建重組表達質粒pETvip-WB5,將其轉化到大腸桿菌BL21,經1mmol/L IPTG誘導表達89kDa大小的Vip3A蛋白.將Vip3A蛋白對斜紋夜蛾的2齡幼蟲進行生物測定,結果表明具有較高的殺蟲活性.蛋白可溶性試驗表明,目的蛋白大部分可溶,透射電鏡觀察無包含體存在,其原因有待進一步研究.在自然條件下進行了目的蛋白的純化,并將純化的蛋白對家兔進行免疫而制備多克隆抗體.將克隆的vip3A-WB5基因插入枯草芽孢桿菌的分泌型表

4、達載體pUS186,構建重組分泌型表達質粒pUS186vip-WB5,將其轉化到具防病、內生和促生的野生型枯草芽孢桿菌BS2中.對工程菌、WB5和BS2室內抑菌、內生和促生作用的實驗表明:工程菌和BS2抑菌活性相當,WB5無抑菌作用;工程菌和BS2能在白菜體內內生定殖,WB5無內生作用;工程菌、WB5和BS2菌液浸種白菜15d后鮮重分別增加155.89％、158.54％和145.27％,對白菜苗都具有促生作用,蘇云金芽孢桿菌WB5對白菜