蘇云金芽胞桿菌新異殺蟲晶體蛋白基因的克隆與基因工程菌WG-001的安全評估.pdf

1、華中農業(yè)大學碩士學位論文蘇云金芽胞桿菌新異殺蟲晶體蛋白基因的克隆與基因工程菌WG001的安全評估姓名：張振宇申請學位級別：碩士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：孫明20051101摘要新的蘇云金芽胞桿菌晶體蛋白的克隆對于控制害蟲對蘇云金芽胞桿菌殺蟲劑的抗性和研究晶體蛋白對蘇云金芽胞桿菌的生物學意義等理論研究都具有重要意義。在本文第一部分中，在以往從“無毒”菌株中發(fā)現其晶體蛋白對特定生物體具有毒殺作用的諸多實例的啟發(fā)下，以實驗室保藏菌種

2、材料中部分晶體蛋白成分較新異且未發(fā)現殺蟲活性的菌株為研究對象，進行了晶體蛋白基因的克隆，并成功的從華中亞種的標準菌株YBT978中成功的克隆到cry7Bal，為cry7群中新亞群，其表達產物對小菜蛾具有商效殺蟲活性；這為尋找新異殺蟲晶體蛋白基因開辟了新的思路。本文第二部分進行了蘇云金芽胞桿菌基因工程菌WG一001的安全評估，包括工程菌WG001的定檀能力、傳播擴散能力、對土著微生物的影響、遺傳變異能力以及特異基因crylAa和crylA

3、c水平轉移能力五個方面的內容，初步證明其對南方蔬菜地土壤環(huán)境有很高的安全性，為其推廣應用提供了安全性實驗數據支持。具體結果如下：1篩選出BMBl518、YBT978、L60、NXPl504、PBt53、HZ3904、LTlL57、NARCBtl7、EAl5196、EAl4696、T70。其中，BM咀1518、YBT978、L60、NXPl504、EAl5196的晶體蛋白已轉至pVDF膜，BMBl519的45kD晶體蛋白、YBT978的1

4、30kD晶體蛋白、EAl5196的42kD晶體蛋白已測得N末端15個氨基酸序列。。2構建了YBT978的基因組BAC文庫。同時根據YBT978的130kD晶體蛋白N末端15個氨基酸序列，采用結合接頭的PCR擴增方法獲得了此130kD晶體蛋白對應基因N端的DNA序列，據此設計了引物130A12和130S12，用于從YBT978的基因組BAC文庫中篩選含有130kD晶體蛋白基因的克隆子。對得到的陽性克隆子進行亞克隆，最終獲得了3465bp的

5、130kD晶體蛋白基因編碼區(qū)，并預測了RBS序列和Btl、BtlI重疊雙啟動子，終止子，以及全部的8個保守區(qū)。此多肽與其它己知的Cry與Cyt蛋白的氨基酸序列比較結果表明它與Cry7Ab2最相似，identity達到了582％；其中，其C端序列非常相似，identi諺為879％，而N端序列的相似度較低，identity為371％。此晶體蛋白已被殺蟲晶體蛋白基因命名委員會命名為Cry7Bal，為Cry7群的新亞群。將cry7Bal轉入無晶

6、體突變株CryB，能形成晶體蛋白與野生菌株YBT978形狀和大小相似的雙金字塔形伴胞晶體，其晶體蛋白成分為預期的130kD大小。生測結果表明，伴胞晶體無毒的YBT978表達的Cry7Bal蛋白在體外溶解后對小菜蛾具有高毒力。由于Cry的N端為其毒力核心區(qū)域，因此根據Cry7Bal的N端與己知Cry的相似度很低的特點，推測此晶體蛋白識別昆蟲中腸上皮細胞上新異的受體，具有很高的開發(fā)價值。cry7Bal的發(fā)現從一定程度上預示在眾多被認為“無毒