分子病理學常用研究技術原理及應用

1、分子病理學常用研究方法原理及選擇,實驗方法在科研工作中的意義,決定本項研究的意義與水平： ①高水平假說+高精尖手段→高水平的研究 ②高水平假說+一般手段→高水平的研究 ③低水平假說+高精尖手段→一般水平的研究 ④低水平假說+一般手段→低水平的研究,From Prof. XW Bian,工欲善其事必先利其器,立題的先進性,手段的先進性,科研水平先進性,,選擇實驗方法的基本原則,必要性,可行性,為什么要選擇這個方

2、法,替代方法,經費,實驗室條件,時間,基于硬件條件，選擇最具有說服力的方法,1．為沒有工作經驗的醫(yī)學研究生編寫一本適合自學的手冊式教材，為他們做課題時更快、更好地選擇合適的實驗技術提供決策參考。2．重點介紹同類實驗技術的發(fā)展沿革、優(yōu)劣比較；不同實驗技術的特點、用途、相互關系、發(fā)展趨勢；各類實驗技術的關鍵、操作要點和選擇示范。3．重點強調醫(yī)學實驗技術的原理與選擇，而非具體操作，亦非理論知識。,常用醫(yī)學實驗動物模型的種類及選擇,組織學實

3、驗技術,細胞生物學實驗技術,分子生物學實驗技術,蛋白質化學技術,免疫學實驗技術,醫(yī)學微生物學實驗技術,醫(yī)學實驗技術原理及選擇,分子病理學常用實驗方法,組織標本取材與固定病理制片切片染色：常規(guī)/特殊原位蛋白質檢測原位核酸檢測,組織取材,固 定,不固定,凍存（不提倡）,凍存,包埋,冰凍切片,HE染色特殊染色IHCISH電鏡,蛋白質、核酸提取,固定,不固定,分子生物學實驗,-20℃保存,IF/IHC/ISH,,,,,,,

4、,,,,,,,,,,,,,,,組織標本一般處理流程,細胞標本一般處理流程,活細胞,細胞爬片,細胞離心涂片,細胞培養(yǎng),離心后包埋制片,凍存,細胞懸液,,,,,,,,,,,,,,,固定,形態(tài)學IHCISH,,Protein/DNA/RNA,分子生物學,IF、FCM,,,,細胞取材方法適用范圍及優(yōu)缺點比較,組織固定,定義：將組織浸入適當化學試劑，使細胞內 物質盡量接近其生理狀態(tài)時的形態(tài)結

5、 構和位置的過程意義： 防止自溶 防止腐敗 最大限度保存細胞和組織的抗原性 保留特殊成分：糖原、核酸、色素等,組織固定的方法,蒸汽固定法,浸入法,灌注法,微波固定法,某些薄膜組織及血液或細胞涂片中的可溶物質,手術取材組織標本和細胞涂片,僅適用于動物實驗,常用固定劑,醛類固定劑,非醛類固定劑,丙酮及醇類固定劑,雙功能交聯劑，可使組織間相互交聯，原位保存抗原對組織穿透力強，收縮

6、性小是最常用固定劑,10%中性福爾馬林液,4%多聚甲醛緩沖液,適用于多肽類激素的組織固定常需與戊二醛或多聚甲醛混合適用降低邊緣效應,穿透性很強，保存抗原活性較好常用于冰凍切片及細胞涂片固定,2.5%戊二醛（電鏡）,組織病理制片技術,常規(guī)組織病理制片,脫水，透明，浸蠟，包埋，切片,組織病理制片技術,組織芯片,近年來基因芯片（DNA芯片）技術的發(fā)展和延伸，與細胞芯片、蛋白芯片、抗體芯片一樣，屬于特殊生物芯片技術,組織芯片技術可將數十個

7、甚至上千個不同個體的臨床組織標本按預先設計的順序排列在一張玻片進行分析研究，是一種高通量、多樣本的分析工具,科研人員可同時研究幾百甚至上千種不同階段病理生理狀態(tài)下的組織樣本的某一個或多個特定基因或相關表達產物,,,Tissue Microarray,組織病理制片技術,顯微切割：microdissection,選取同質性研究材料，是在對組織的深入研究中常常遇到卻又不易解決的問題,該技術是在顯微狀態(tài)下或顯微直視下通過顯微操作系統對選擇的材料

8、（組織、細胞、細胞群、細胞內組分或染色體帶等）進行切割分離并收集用于后續(xù)研究的技術,細微：微米、納米級切割原位：所取材料定位清楚同質：所取材料在一定層次上相同結合：與其他實驗技術結合,顯微切割技術的特點,顯微切割本身不能對樣品進行研究，必須同其他實驗技術結合，其切割目標完全取決于研究目的,顯微切割的方式,手動直接顯微切割,機械輔助顯微切割,液壓控制顯微切割,激光捕獲顯微切割（laser capture microdessec

9、tion, LCM）,全自動組織處理機,石蠟包埋機,石蠟切片機,震蕩切片機,硬組織切片機,冰凍切片機,冰凍切片機,常用組織切片染色方法,未經染色的組織切片各部分折射率差別很小，即使有足夠的分辨率和合適的放大倍數，也無法直接在光鏡下觀察。通過適當的染色，增大各部分結構折射率差別，提高分辨率,蘇木精－伊紅染色（HE）,HE染色能非常鮮明地對組織和細胞染色，是最基本、使用最廣泛的技術方法，又被稱為常規(guī)染色。,DNA帶負電荷，呈酸性，與帶正電

10、荷的蘇木精堿性染料以離子鍵或氫鍵形式結合，呈藍色,伊紅Y為一種合成酸性染料，在水中離解成帶負電荷的陰離子，與嗜酸性物質結合呈紅色,特殊染色,顯示HE染色不明顯的目的物，如Gridley染色能突出顯示感染的霉菌區(qū)別常規(guī)HE染色不能鑒別的病變，如V.G染色可區(qū)分膠原纖維和平滑肌顯示某些常規(guī)HE染色中不能看到的目的物，如網狀纖維、星形細胞的突起和結核桿菌等,結締組織染色,膠原纖維染色,Van Gieson氏苦味酸—酸性品紅染色法（簡稱V.

11、G法）Masson氏三色染色法Mallory氏三色染色法Pollak氏三色染色法Sirius Red苦味酸法等,分布最廣、含量最多的一種纖維,來源于間胚葉的腫瘤如纖維瘤、平滑肌瘤、橫紋肌瘤、神經纖維瘤及其肉瘤等的診斷和鑒別診斷。在慢性炎癥、機化和瘢痕形成等病變中顯示膠原纖維，如慢性腎小球腎炎的腎小球纖維化、大葉性肺炎、血栓機化、風濕性肉芽腫時Aschoff’s巨細胞消失、胃、十二指腸潰瘍愈合、慢性闌尾炎、肝硬化。血管壁的膠原

12、纖維染色對病理診斷有重要意義。如良性高血壓的小動脈玻璃樣變（V.G陽性）；惡性高血壓小動脈管型纖維素樣壞死（V.G陰性而纖維素染色陽性）；高血壓性腎固縮，其小動脈V.G陽性呈紅色，而淀粉樣物質沉積的小動脈壁V.G染色呈黃色,膠原纖維染色的應用,在病理診斷上主要用于和肌纖維相鑒別,結締組織染色,網狀纖維染色,是網狀結締組織內的一種纖維，纖細而有分支，直徑約0.2~1mm，無彈性，穿行于細胞體之間，共同構成網狀支架。HE染色不易辯識，用銀氨

13、溶液浸染能使纖維變成黑色，故稱嗜銀纖維,主要分布在淋巴組織、骨髓、扁桃體、胸腺、基底膜、血管（特別是毛細血管）、脾竇、肝竇、肌纖維周圍、神經纖維、脂肪細胞周圍及肺泡等,結締組織染色,網狀纖維染色,Perdrau氏法、 Foot氏法、氫氧化銀液法、Wilder氏氫氧化銀液法、James氏法、Naoumemko-Feigin氏法、Del Rio-Hortega氏法、Hortega氏法、Bielschowsky氏法、Hamason-

14、Lushbangh氏法、醋酸氨銀染色法（汪榮法）和組織塊鍍銀法等,常用于區(qū)別癌和肉瘤：癌巢周圍常有網狀纖維包裹；用于基底膜染色，鑒別原位癌或原位癌早期浸潤。鑒別血管內皮瘤和外皮瘤：血管內皮瘤瘤細胞呈泡巢狀，周圍被網狀纖維包繞；血管外皮瘤瘤細胞間可見較多網狀纖維。區(qū)別腦腫瘤：腦原發(fā)性肉瘤周圍有較多網狀纖維、腦血管周圍肉瘤組織內有較多網狀纖維，其它腦腫瘤少見網狀纖維,網狀纖維染色的應用,結締組織染色,彈力纖維染色,彈力纖維（Elasti

15、c fiber）廣泛分布于身體各處，以肺泡壁、動脈壁和皮膚最為豐富。直徑約0.2~1mm，纖維分支，交織成網，電鏡下無周期性橫帶。對沸水、弱酸和堿有一定抵抗力，但可被胃液、胰液等消化,間苯二酚品紅法、醛品紅法、地衣紅法、Verhoeff氏法、Hart氏法、酸性地衣紅姬姆薩法、醛復紅阿辛藍法、堿性藍B染色法、彈力、膠原纖維的雙重組合染色法和顯示膠原、網狀和彈力纖維的三聯法,彈力纖維增生：原發(fā)性或繼發(fā)性高血壓的小動脈、皮膚彈力纖維瘤、老年彈

16、力纖維增生癥、心內膜彈力纖維增生癥、乳腺癌的彈力纖維增生等。彈力纖維斷裂、崩解：老年性肺氣腫、主動脈粥樣硬化、梅毒性主動脈炎、皮膚環(huán)狀肉芽腫等。,彈力纖維染色的應用,肌肉組織染色,A.V.G法、Mallory三色染色法、Gomori多色染色法、Gomori氏改良多色染色法、鐵蘇木素法、偶氮桃紅染色法、橫紋肌的組織塊染色法、蘇木素堿性品紅苦味酸法、酸性復紅光綠染色法、酸性復紅染色法、CV-AF染色法和變色酸2R亮綠染色法等,未分化間葉性

17、腫瘤，如橫紋肌肉瘤的來源確定炎癥滲出纖維素、彌散性血管內凝血的纖維素染色神經膠質瘤研究,脂類染色,中性脂肪（甘油三酯 ）染色,蘇丹Ⅲ、蘇丹Ⅳ、蘇丹黑及油紅O,膽固醇及膽固醇酯染色,硫酸鐵銨法、高氯酸萘醌法、醋酸銅脂肪酸染色法、酸性蘇木因染色法等,動脈粥樣硬化病灶、腫瘤組織壞死灶、細胞內類脂沉積、脂性腎病的腎小管、腎上腺皮質中膽固醇類激素含量增減的測定,磷脂染色,由甘油、脂肪酸、磷酸和含氮的堿基組成，是細胞膜和細胞內膜性結構的主要組成

18、成分，在大腦、神經組織、骨髓和肝臟等含量較多,常用顯示方法有酸性蘇木素法和吡啶提取法,神經組織主要由磷脂和糖脂構成，用此法可以顯示磷脂，用PAS顯示糖脂,糖原染色,糖原又名肝糖，以大小不等的顆粒貯存于肝細胞及肌細胞漿中，遇碘變褐色，易溶于水機體壞死后，糖原即被破壞，須取新鮮標本并及時固定,碘酸-Schiff氏法（PAS）,能打開多糖類結構的乙二醇基（-CHOH-CHOH-）或氨羥基（-CHOH-CHNH2-）的碳鍵，生成醛基化合物，暴

19、露出游離醛基（-CHO）。再與無色品紅液作用，生成新的紅色或紫紅色復合物，即Schiff反應。糖原被染成紅色，細胞核呈藍色,該方法對含乙二醇基或氨羥基的多糖呈陽性反應急性心肌缺血時心肌糖原消失，饑餓時肝糖原減少，糖尿病時肝、腎、腎曲小管可出現大量糖原,色素染色,含鐵血黃素染色,鑒別組織或細胞中的黃棕色色素性質,黑色素染色,含黑色素的組織切片在HE染色中容易與含鐵血黃素、脂褐素等混淆,脂褐素染色,在老年性萎縮和惡液質患者的實質細胞、病毒

20、性肝炎時星形細胞內有脂褐素出現,膽色素染色,化學成分是膽紅素和橙色血質，為不含鐵的血紅蛋白分解產物,鈣鹽染色,病理性鈣化是常見病理變化,神經組織染色,尼氏體染,緩沖亞甲藍法（Pischingert法）、混合染色法（焦油紫、硫堇、亞甲藍、甲苯胺藍法）、Thionine氏硫堇法、甲苯胺藍法、焦油紫法、培花青法等,尼氏體的存在或消失是神經細胞是否受損的重要指標。腦缺血、腦炎、脊髓前角灰質炎及軸突反應等病變時，神經元受損，尼氏體可溶解消失,神經

21、軸突染色,軸突有嗜銀性，常用銀浸鍍法、甘氨酸銀浸鍍法和Holmes氏法染色,周圍神經干病變可用此法了解神經纖維破壞程度及范圍，如麻風病、維生素B1缺乏癥或一些中毒性周圍神經疾病等,神經髓鞘染色,髓鞘（myelin）是包裹在神經軸突外面的節(jié)段性管狀鞘，是由雪旺氏細胞的胞膜（周圍神經纖維）或少突膠質細胞的胞膜（中樞神經纖維）包卷軸突作螺旋狀盤繞。髓鞘由鞘磷脂構成，含60%的類脂質和40%的蛋白質,碳酸鋰蘇木素法、砂羅鉻花青法、四氧化鋨法、W

22、eil氏鐵明礬蘇木素法、Weigert鐵蘇木素法、Kultsohitsky酸性蘇木素鋨酸法、Luxol氏堅牢藍甲苯酚紫法和Marchi氏鋨酸法等。,神經膠質細胞染色,氯化金升汞法、PTAH法、Holzer氏磷鉬酸結晶紫法、Scharenberg氏法、Rio-Hortega氏法等，均屬鍍金法，在加入二氯化汞的氯化金溶液中，星形膠質細胞具有嗜金性。神經膠質細胞瘤與腦膜瘤、室管膜瘤等鑒別時往往需要做膠質細胞染色,核酸及核蛋白染色體染色,Fe

23、ulgen氏染色,顯示DNA的一種常用方法?；驹硎窃谒崴庀?，去除DNA中的嘌呤，暴露出脫氧核糖核酸的醛基，后者再與Schiff氏試劑反應，生成紫紅色產物，用顯微分光光度計和流式細胞測量計對細胞分別進行靜態(tài)DNA測量和流式細胞測量,核仁組成區(qū)（NORS）蛋白染色,是rRNA的染色體片段，與嗜銀酸性非組蛋白有關。rRNA基因直接控制著核糖體和蛋白質的合成。計數細胞內NORS的數量可反映細胞增殖的情況。經典方法是銀染法，如PLOTON改

24、良法，鏡下NORS位于細胞核內呈黑色的顆粒狀,病理內源性沉著物染色,纖維素染色,甲基紫、MSB和PAS等染色法。炎癥滲出性改變、DIC、高血壓的小血管壁及一些膠原性疾病的疏松纖維,淀粉樣物質染色,剛果紅染色法（淀粉樣物質呈紅色，細胞核呈藍色）和甲基紫染色法（淀粉樣物質呈紅色或紫紅色，細胞核呈藍色）?？捎糜谳o助診斷全身消耗性疾病、區(qū)分淀粉樣變性與其他變性、腫瘤的診斷與鑒別等,病原微生物染色,真菌染色,細菌染色,螺旋體染色,病毒包涵體染

25、色,原位蛋白質檢測,定位定性定量,免疫組織化學,酶組織化學,immunohistochemistry，IHC,enzymohistochemistry，EHC,免疫組織化學,以抗原－抗體反應為理論基礎以化學方法顯示抗原－抗體反應結果定位、定性或定量檢測組織和細胞內特定抗原或抗體,免疫組織化學與免疫細胞化學本質上一致，習慣上共同稱為免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC），也可稱為原位免疫學（in situ

26、 immunology）,IHC的基本知識,抗原,由抗原分子表面的抗原決定簇（antigenic determinant）決定其免疫原性，也是抗原與抗體特異結合的基本單位，也稱抗原表位（epitope）,抗體,多克隆抗體（polyclonal antibody, pAb）,單克隆抗體（monoclonal antibody,mAb）,基因工程抗體,多克隆抗體（polyclonal antibody, pAb）,又叫血清抗體，機體接受抗原

27、主動或被動免疫后，從血清中分離提純的抗體。pAb由多個B細胞克隆針對不同的抗原決定簇而產生，特異性較低，與其他抗原間存在交叉反應，使背景著色較高。各批次間可能存在特異性和親和性的差別。pAb制備程序簡單，易大量獲得，成本較低，在一些特異性要求不高的實驗中，仍在廣泛應用。,單克隆抗體（monoclonal antibody,mAb）,Milstein & kÖhler，1975原理：抗原免疫小鼠，將小鼠脾臟淋巴細胞

28、與體外培養(yǎng)的人骨髓瘤細胞株在一定條件下融合，形成可長期存活并能分泌抗體的雜交瘤（hybridoma）細胞，將其分離培養(yǎng)后形成單個瘤細胞克隆。培養(yǎng)上清或將雜交瘤細胞注入裸鼠腹腔產生的腹水中就含有瘤細胞分泌的抗體，這就是mAbmAb由一個瘤細胞克隆產生，只針對一個抗原決定簇，所有抗體分子在結構上完全一致，具有高度特異性和穩(wěn)定性,基因工程抗體,采用DNA重組技術生產的抗體－第3代抗體1989年Huse等首次構建抗體基因庫，使抗體研究從體內

29、和細胞水平進入到分子水平基因工程抗體包括嵌合抗體、人源性型抗體、完全人源化抗體、單鏈抗體、雙功能抗體、片段抗體等重組抗體的體積越來越小，或被重新構建成多價分子，或與其它分子融合，如放射性核素、毒素、酶、脂質體和病毒等重組技術的出現使抗體改造成為可能，并取代雜交瘤技術，為以抗體為基礎的生物藥物研發(fā)開拓了廣闊前景,抗體標記,Ag-Ab復合物并不可見，必須將抗體加以標記并利用標記物與其他物質的反應，形成可見的發(fā)光或顯色,能與抗體形成牢固

30、的共價鍵結合；不影響抗原抗體結合；具有信號放大效應；發(fā)光或顯色反應要發(fā)生在抗原－抗體結合原位與周圍有較高對比度,熒光標記物,黃色結晶粉末明亮的黃綠色熒光,FITC,紫紅色粉末橙紅色熒光,TMRITC,兩種標記物顏色對比鮮明，可用于雙重標記熒光染色。,酶標記物,免疫酶組織化學法：用酶蛋白標記抗體。通過免疫反應后追加標記物酶催化底物的組織化學反應，得到具有一定電子密度的有色產物，可用光學及電子顯微鏡觀察。,酶活性高而穩(wěn)定終產物

31、穩(wěn)定不擴散酶與抗體結合不影響Ag-Ab特異性反應組織與體液中不存在內源性酶及其底物,酶標記物,辣根過氧化物酶(HRP),(1)體積小，不會遮蓋抗原的結合部位，穿透力強(2)穩(wěn)定且易獲得高純度酶制品(3)具較高活性及特異性(4)不溶性好，終產物不向周邊擴散(5)內源性酶較少，抑制方法較多(6)價格相對較便宜(7)特異性底物是過氧化氫(H202)，可選用不同發(fā)色基團（電子供體），使終產物呈不同顏色,HRP+H2O2→HRP.

32、H2O2HRP.H2O2+DH2→HRP+D+2H2O,DAB是廣泛應用的電子供體，產物為棕黃色顆粒，不溶于水和有機溶劑 有潛在致癌性,堿性磷酸酶(AKP),酶標記物,磷酸萘酯＋H2O→α－萘酚＋磷酸鹽α－萘酚＋偶氮染料→有色沉淀,分子大（100kDa），穿透力較弱某些組織細胞內含有較高的內源性AKP，干擾染色,不溶于有機溶劑，切片不易褪色呈色反應的敏感性比HRP高2-3倍，顯色時間從30min到48h其產物為鮮紅色，可與H

33、RP組合進行IHC的雙重或多重標記,缺點,優(yōu)點,葡萄糖氧化酶（glucoseoxdase，GOD）,其他標記物,膠體金和鐵蛋白：免疫電鏡技術的主要標記物,棗紅蛋白與FITC共同用于雙重標記,親和組織化學標記物,抗體標記,利用具有親和特性的物質對間的高度親和性，將酶、熒光等標記物與親和物質連接，對抗原或其他靶物質進行定位和定量的方法,生物素-親和素激素-受體植物凝集素-糖類葡萄球菌A-IgG Fc片段,生物素－親和素系統,生物素（b

34、iotin）－vitamin H親和素（avidin）－卵白素或抗生物素蛋白（antibiotin），由4個相同亞基組成，1分子親和素可結合4分子生物素二者以非共價鍵不可逆結合，其親和力是抗原－抗體親和力的100萬倍，是自然界已知結合最緊密的物質對之一,生物素分子量小，1分子抗體可結合約150個生物素不影響抗體與抗原結合，也不影響與之結合的酶活性親和素可與熒光素、酶等標記物偶聯具有敏感性高、特異性強、穩(wěn)定性好和方便快速等特點

35、以不與內源性生物素結合的鏈霉親和素來代替親和素,,Conjugated avidin,常用抗體標記技術比較,IHC主要染色方法及原理,5S：specificitysensitivitysimplicitysafelysave,直接法間接法PAP法APAAP法ABC法 ——,直接法（direct method）,用熒光素或酶標記的特異性抗體，直接與待檢組織中的抗原反應，又稱一步法,操作簡單，特異性高而敏感性低抗體需

36、單獨標記，生產成本高最常用于腎活檢組織及結締組織病皮膚活檢標本的IgG、IgA、IgM及補體等免疫相關蛋白的檢測也用于FCM測定各種細胞表面抗原,間接法（indirect method）,又稱夾心法（sandwich method），分兩步檢測抗原或抗體。檢測抗原時，先以未標記的特異性抗體（第一抗體）與組織或細胞中的抗原反應，洗去未結合的抗體后，再以酶或熒光素標記的第二抗體（抗抗體）與第一抗體結合，再顯色或熒光檢查。,敏感性是直接法

37、的3-5倍，但特異性有所降低最大優(yōu)點在于不必標記每種第一抗體，只需要標記數量有限的第二抗體，利于商品化生產,非標記抗體法,抗體與酶或熒光素結合不可避免地會降低抗體與抗原結合能力，并影響標記物本身活性,酶橋法（enzyme bridge technique）,PAP法（peroxidase antiperoxidase method）,APAAP法,親和素-生物素法,親和素-生物素-過氧化物酶復合物技術（avidin biotin- p

38、eroxidase complex technique，ABC）,ABC復合物由親和素與酶標生物素以一定比例結合而成，親和素作為橋梁，將ABC復合物與生物素化的抗體結合起來，再由抗體檢出抗原,最大優(yōu)點是敏感性高，背景干凈，是目前應用最為廣泛的免疫組化方法,親和素-生物素法,酶標親和素－生物素技術（labeled avidin-biotin technique，BA或LAB技術）,用親和素分子直接與酶分子結合，形成酶－親和素復合物，再與生

39、物素標記的二抗結合，其敏感性較ABC法又有數倍提高。如用鏈霉親和素（streptavidin, SA）代替親和素，又衍生出LsAB法，該法避免了與切片中內源性生物素結合，特異性更高。,EnVision法,利用線狀葡聚糖分子與大量酶結合，再將葡聚糖－酶復合物(EnVision復合物)連接到二抗上，形成酶－葡聚糖－二抗復合物，復合物中酶分子絕對數量遠高于其他復合物（可達150個）；同時存在多個第二抗體（15個），增加了該復合物與特異性抗體的

40、結合機會，具高度放大作用。,催化放大系統（catalyzed signal amplication, CSA法）,原理是增加了生物素化的酪胺基團分子，通過HRP的催化作用，使酪胺基團分子與抗原抗體結合部位形成一個共價結合位點，使大量生物素沉積在信號位點上，當再次滴加鏈霉親和素－HRP復合物時，原始信號得到幾何級放大。,常用IHC方法比較,IHC主要方法演進示意圖,酶組織化學技術,酶（enzyme）－生物體內催化各種化學反應和新陳代謝的特

41、殊蛋白質,組織細胞內的酶并不直觀可見，但酶可催化特定底物產生相應反應產物，通過檢測產物即可在酶所在部位獲得相應信號。這種通過酶的作用形成反應產物，經捕捉反應產物信號來顯示細胞和組織結構中的各種酶，對其進行定性、定位和定量分析的方法稱為酶組織化學技術,1950s廣泛應用于病理學，操作復雜，必需新鮮組織以保持酶活性,反應特異性較低，限制了其應用,酶本身為蛋白質，具有抗原性，可用IHC檢測,酶組織化學技術,金屬沉淀法,底物經酶分解后，其產物可

42、與大多數金屬結合，如金、銀、銅、鐵、鉛、鈷及其化合物，產物呈特定顏色,偶聯偶氮法,基本原理是應用特定人工合成底物進行酶促反應，其分解產物再與重氮鹽結合，引起偶聯偶氮反應，形成不溶性偶氮色素,色素形成法,無色底物經酶促反應，在局部形成色素沉著對酶定位,酶組織化學技術,堿性磷酸酶,酸性磷酸酶,三磷酸腺苷酶,琥珀酸脫氫酶,過氧化物酶,過氧化氫酶,膽堿乙酰轉移酶,常用酶組織染色法檢測的酶,原位核酸檢測,核酸分子雜交（nucleic acid m

43、olecular hybridization）是檢測核酸分子間序列同源性的一種技術。原理：核酸間的堿基互補結合，及DNA高溫變性低溫復性不同來源單鏈核酸只要彼此間存在互補順序，就可復性形成雜交體。鏈間序列互補程度越高，越容易結合形成雜交體結構且更加牢固不易洗脫。,原位核酸檢測,常用技術,,原位雜交（ISH）,熒光原位雜交（FISH）,原位PCR,引物介導的原位標記技術（PRINS）,原位雜交：in situ hybridizatio

44、n,1969年由Pardue和John等人在不同的實驗室?guī)缀跬瑫r建立,應用已知堿基順序并帶有標記物的探針（probe），與待檢標本上的核酸特異性結合形成雜交體，再用與標記物相對應的檢測系統，在被檢測的核酸原位形成帶顏色的雜交信號，用顯微鏡或電子顯微鏡進行細胞內定位。,組織切片預處理,探針制備,最大限度地保持細胞內DNA或RNA的完整性,組織具有良好的通透性,探針的標記,放射性標記,,優(yōu)點：敏感性和特異性均較高,缺點：有放射污染、成本高、

45、實驗周期較長,3H，35S，32P，14C和125I等,非放射性標記,熒光素,優(yōu)點是耗時短，操作簡便，干擾因素少，多用于新鮮或冷凍組織、細胞和染色體的原位檢測缺點是探針成本較高，需熒光顯微鏡觀察并及時采圖熒光素本身為半抗原，可經抗體檢出,探針的標記,非放射性標記,生物素（biotin）,地高辛（digoxin）,人類和動物組織中均無類似物，特異性極高作為半抗原，地高辛也可由抗地高辛抗體檢出已成為目前應用最廣泛的非放射性標記物,雜

46、交,雜交后清洗,雜交體檢測,去除非特異信號，減少背景著色，以獲得較高信/噪比（signal/noise）,標記探針和待檢樣品上的靶序列通過堿基互補配對相結合而形成雜交體的過程,放射自顯影,熒光顯微鏡,免疫組織化學技術,ISH的應用,定位細胞內特異性mRNA的轉錄，用于基因圖譜、基因表達和基因組進化的研究；感染組織中病毒DNA/RNA的檢測和定位；癌基因、抑癌基因及各種功能基因在轉錄水平的表達及其變化；基因在染色體上的定位；染色體

47、變化，如數量異常和染色體易位等；間期細胞遺傳學研究，如遺傳病的產前診斷和某些遺傳病基因攜帶者的確定某些腫瘤的診斷和生物學劑量測定,熒光原位雜交－FISH,1986年由Dilla首次建立,用熒光物質標記DNA探針，通過ISH檢測靶DNA,FISH常為DNA-DNA雜交,FISH的探針,重復序列探針（repeat sequence probes）位點特異性探針（one locus specific identifier probe，L

48、SI ）染色體探針（Chromosome painting probes）單一序列探針（Single sequence probes）由其它載體攜帶的小片段DNA探針 （small fragments of DNA inserted in other carriers）,將已知堿基序列的特異DNA片段作為探針，標記上不同熒光素，與靶核酸進行DNA-DNA原位雜交，可在熒光顯微鏡下直接觀察結果,直接法FISH,優(yōu)點是簡單、快速。

49、,缺點是信號較弱，敏感性較低,間接法FISH,探針常用生物素或地高辛等非熒光素標記雜交后通過親和連接或免疫反應，帶入各種發(fā)光物質來檢測雜交體的存在對雜交信號有逐級放大作用，從而增加了雜交的敏感性,FISH的應用,基因進化研究,繪制基因圖譜,染色體數量和形態(tài)結構異常,腫瘤細胞遺傳學研究,比較基因組雜交（CGH）,原位PCR,原位PCR技術的基本原理是PCR和ISH技術的結合先在組織切片上進行PCR反應擴增待檢基因，再與擴增后的DNA

50、原位雜交,固定細胞和組織酶消化處理，提高細胞通透性，充分暴露核酸于PCR反應體系中在原位PCR儀上進行反應結果檢出,原位PCR大致操作流程：,原位PCR的分類,根據dNTP或引物標記與否,直接法,間接法,根據標記物性質和擴增產物檢測方法,原位反轉錄PCR,原位再生式序列復制反應,直接法原位PCR,應用標記的dNTP或引物，對樣本進行PCR擴增時，標記分子就摻入到擴增產物中，擴增產物可直接觀察而不需再進行原位雜交,優(yōu)點是擴增產物直接

51、攜帶標記分子，實驗簡便省時擴增效率較低特異性較差，易出現假陽性當對dNTP進行標記時，dNTP可能因為非靶DNA自身修復而摻入到其中，成為非特異信號引物和模板的錯配也常導致假陽性,間接法原位PCR,先將引物、核苷酸及酶等反應物加入細胞內進行擴增（PCR），再用特異標記探針與擴增產物進行原位雜交（ISH）,優(yōu)點是克服了直接法導致的非特異信號，提高了擴增效率和反應的特異性，成為目前應用最廣的原位PCR技術缺點是該方法為原位PCR和

52、ISH技術的結合，操作復雜，耗時較長；也存在著引物錯配可能產生非特異性信號的問題。但因不需標記dNTP，非特異性信號低于直接法原位PCR,原位反轉錄PCR,將反轉錄反應和PCR結合，用于檢測細胞內低拷貝mRNA反應先以mRNA為模板進行逆轉錄反應合成cDNA再以該cDNA為模板進行PCR標本需經DNA酶預處理去除細胞內的DNA，以保證PCR所擴增的模板cDNA是mRNA的逆轉錄產物,原位再生序列復制反應(self-sustaine

53、d sequence replication reaction),以mRNA為模板，通過逆轉錄酶、DNA聚合酶和RNA酶的作用，以RNA/cDNA和雙鏈cDNA為中間體，直接擴增RNA靶序列擴增反應在42℃下進行兩小時，不需要熱循環(huán)該法為檢測細胞內低拷貝數mRNA提供了一個新方法因擴增反應在較低溫度下進行，組織抗原保存較好，便于和IHC相結合,原位PCR的不足,①特異性不高，特別是假陽性不可避免,②技術操作復雜，影響因素多,③需要