鵝垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子(PIT-1)基因啟動子的克隆及調(diào)控區(qū)的初步鑒定.pdf

1、垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子1(PIT-1)是重要的組織特異性轉(zhuǎn)錄因子,也是調(diào)控垂體內(nèi)GH、PRL、TSH-β轉(zhuǎn)錄的重要反式作用因子,對動物早期的發(fā)育和相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控起重要的作用,認(rèn)為是與生長相關(guān)和作為研究動物生長機(jī)制的重要候選基因之一。但目前在畜禽上,該基因研究還不夠深入,尤其是對該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平的研究,本研究以鵝為實驗對象,成功地克隆了PIT-1基因啟動子區(qū)序列,并對該區(qū)域從轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面進(jìn)行初步研究。
　　 1.鵝PIT-1基因

2、啟動子區(qū)域克隆及序列分析
　　 本實驗利用基因組步移技術(shù),首次從鵝基因組中克隆到了共約3.0kb的PIT-1基因5'啟動子區(qū)序列,序列已提交到Genbank(序列號:EU924269)。
　　 利用在線軟件對所得結(jié)果進(jìn)行了序列分析和物種間PIT-1基因5'啟動子區(qū)序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。結(jié)果表明所克隆的片段中含有兩段啟動子,分別命名為近端和遠(yuǎn)端啟動子,且都含有典型的TATA框和CAAT框,還預(yù)測到一些轉(zhuǎn)錄元件,如myo

3、genin,TFIID,GATA-1,AP-1,GR,HOXD10,TCF-4E,PRA,Sp1,POU1F1a,POU3F2,GATA-4,Foxj2等。序列比對結(jié)果表明,不同物種PIT-1基因的同源序列主要集中在轉(zhuǎn)錄起始點上游-200bp至-1000bp區(qū)域。轉(zhuǎn)錄起始點上游-200bp區(qū)域保守性比較強(qiáng),很可能為核心啟動子序列,且鵝與雞的同源性最高。同時,本實驗使用Vista中的MLAGAN程序構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果反映了不同物種間進(jìn)

4、化關(guān)系。
　　 2.啟動子區(qū)功能的鑒定和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究
　　 利用基因組步移獲得了鵝PIT-1基因的啟動子區(qū)序列,采用了系列缺失法成功構(gòu)建了一系列啟動子缺失突變體(-2995/-1 bp,-1485/-1 bp,-1293/-1 bp,-1014/-1bp,-775/-1 bp,-561/-1 bp,-353/-1 bp,-206/-1 bp),使用構(gòu)建熒光素酶報告基因載體和瞬時轉(zhuǎn)染分析法進(jìn)行啟動子區(qū)活性的檢測和轉(zhuǎn)錄調(diào)控