440nm藍光聯(lián)合核黃素角膜交聯(lián)治療細菌性角膜炎的實驗研究.pdf

1、細菌性角膜炎是由細菌感染導致的角膜炎癥，可引起角膜上皮缺損和基質壞死，是一種嚴重危害視力的眼部疾病。其中尤以金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌感染最常見、最嚴重。其治療目前主要依靠局部滴用抗生素滴眼液，但是因受到多種外界因素以及濫用抗生素的影響，部分細菌發(fā)生變異而產生一定的耐藥性，導致治療效果不佳，Chang VS回顧分析了20年里葡萄球菌感染的角膜炎，發(fā)現(xiàn)耐藥率達30.7％。對于遷延不愈的角膜潰瘍，有人嘗試結膜瓣或羊膜覆蓋，但這會降低滴眼液的滲

2、透性，必須在感染控制后才能做此手術。感染嚴重致角膜溶解時，只能行角膜移植手術治療，但是角膜材料有限，且術后常會出現(xiàn)排斥反應或炎癥復發(fā)，以至于相當一部分患者最終不得不進行眼球摘除術來根治。
　　角膜交聯(lián)術(CXL)是通過合適的光源照射激發(fā)核黃素產生活性氧族，誘導角膜膠原纖維的氨基之間發(fā)生光化學交聯(lián)反應，從而增加了膠原纖維的機械強度和抵抗角膜擴張的能力，已廣泛應用于角膜擴張病變，療效肯定。2000年，Scnitzler E首次報道了C

3、XL用于治療角膜潰瘍有效，之后大量的臨床報道證實CXL是一種新的、有效的治療感染性角膜炎的方法。相對于大多數(shù)抗生素只能從殺滅病原體一方面治療角膜炎，CXL可以從消除病原體、增加角膜的抗酶活性以及減輕相關炎癥反應三方面來治療角膜潰瘍，給角膜潰瘍的治療帶來了新的曙光。波長270nm左右的紫外光B、370nm左右的紫外光A、445nm左右的藍光同為核黃索的吸收峰，均可以激發(fā)核黃素產生交聯(lián)反應。光線的穿透能力與其波長呈正比，波長越長，穿透力越強

4、，370nm紫外光A僅能穿透300um的角膜，440nm藍光介導的交聯(lián)深度應該較370nm紫外光更深，而細菌性角膜炎時角膜均會水腫變厚，潰瘍深度往往會超過300um，據(jù)此，設想440nm藍光介導的交聯(lián)治療嚴重角膜潰瘍的效果應該優(yōu)于370nm紫外光A。1998年，Spoerl E等人報道了465nm藍光聯(lián)合核黃素誘導的CXL可以起到加固離體豬角膜的作用，2008年Iseli報道藍光CXL可以增加鞏膜膠原纖維的機械強度。但440nm藍光聯(lián)合

5、核黃素誘導角膜交聯(lián)治療角膜潰瘍尚未見報道。本文第一部分應用440nm藍光聯(lián)合核黃素對金黃色葡萄球菌感染的兔角膜潰瘍進行了交聯(lián)治療，旨在觀察驗證其對細菌性角膜潰瘍的治療效果，并與370nm紫外光A進行比較，觀察其療效是否優(yōu)于后者。第二部分初步觀察了440nm藍光核黃素交聯(lián)治療金葡菌角膜潰瘍，是否對角膜內皮、視網膜、脈絡膜等眼部組織有損害。
　　第一部分 440nm藍光核黃素角膜交聯(lián)治療細菌性角膜炎的療效研究
　　目的:

6、　　通過動物實驗觀察440nm藍光核黃素角膜交聯(lián)治療金黃色葡萄球菌角膜潰瘍的療效，與空白對照組對比，觀察其治療是否有效;與370nm紫外光A聯(lián)合核黃素角膜交聯(lián)治療組對比，觀察其治療效果是否優(yōu)于后者。
　　方法:
　　1.實驗設計:選取60只健康新西蘭大白兔，右眼為實驗眼，全麻后中央角膜淺基質層內注入0.1ml濃度為5×107cfu/ml金黃色葡萄球菌菌液，制作金黃色葡萄球菌感染的較嚴重的角膜潰瘍模型，將造模成功的54只納入研

7、究，隨機分為三組，每組18只。其中18眼行440nm波長藍光核黃素角膜交聯(lián)，18眼行370nm紫外光A核黃素角膜交聯(lián)，另外18眼作為空白對照組，僅在另外兩組行交聯(lián)治療的同時，給予一次刮除潰瘍表面疏松壞死組織治療。于交聯(lián)后第1天、3天、7天、14天分別觀察比較各組療效。
　　2.角膜交聯(lián)方法:10％水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉，角膜測厚，確保最薄點大于400um。去除角膜中央直徑9mm疏松潰瘍組織及殘存上皮，1g·L-1核黃素溶

8、液滴角膜每4-5min1次，共30min。440nm藍光和370nm紫外光A照射能量均為3mw·cm-2，照射直徑均為9mm，工作距離50mm，照射角膜時間均為30分鐘。
　　3.觀察指標:交聯(lián)后1天、3天、7天、14天，觀察眼部分泌物、結膜充血、前房積膿及角膜浸潤情況，給予炎癥評分并行統(tǒng)計學分析;分別給予角膜照相并利用Image J軟件對潰瘍面積進行比較分析;同時蘸取所有實驗眼潰瘍表面壞死組織或分泌物進行細菌培養(yǎng)。交聯(lián)后1天、7

9、天、14天共焦顯微鏡觀察炎癥細胞變化，各組分別摘取兩實驗眼角膜，制作切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察其病理組織學改變。
　　結果:
　　1.三組實驗眼眼部炎癥評分比較:CXL治療前，三組實驗眼眼部炎癥評分無統(tǒng)計學差異(P=0.814，P＞0.05)。CXL治療后第1天、3天、7天、14天，三組眼部炎癥評分的差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.000、0.000、0.000、0.000，P＜0.05)，440組與對照組比較，差異均有統(tǒng)

10、計學意義(P=0.001、0.000、0.000、0.000，P＜0.05)，370組與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.000、0.000、0.000、0.000，P＜0.05)，440組和370組比較均無統(tǒng)計學差異(P=0.557、0.567、0.488、0.537，P＞0.05)。至觀察結束，對照組所有實驗眼均角膜穿孔。
　　2.每組眼部炎癥評分變化:440組五個時間點評分有統(tǒng)計學差異(P=0.000，P＜0.05)，

11、呈下降趨勢。370組四個時間點評分有統(tǒng)計學差異(P=0.002，P＜0.05)，也呈下降趨勢。對照組四個時間點眼部炎癥評分有統(tǒng)計學差異(P=0.000，P＜0.05)，呈上升趨勢。
　　3.三組實驗眼角膜潰瘍面積比較:角膜交聯(lián)治療前及治療后第1天、第3天，三組角膜潰瘍面積均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05，P=0.881、0.845、0.066);治療后第7天、第14天，對照組角膜潰瘍面積顯著大于440組和370組(P＜0.05，q=5

12、.895、5.571)，而440組和370組角膜潰瘍面積無統(tǒng)計學差異(P＞0.05，q=0.323、0.582)。
　　4.三組實驗眼細菌培養(yǎng)結果:CXL前三組兔眼細菌培養(yǎng)均為陽性。CXL后第1天、3天、7天、14天，440組和370組細菌培養(yǎng)均轉為陰性，而對照組均為陽性。
　　5.三組實驗眼病理結果:CXL后第1天，病理切片三組均可見角膜上皮缺失，大量炎性細胞聚集達深基質;第7天，對照組形成角膜全層膿腫，但后彈力膜尚完整，

13、370組和440組可見角膜上皮多層愈合，潰瘍組織內見新生血管、大量炎細胞及少量纖維母細胞增生;第14天，對照組潰瘍加重，形成全角膜膿腫，后彈力膜僅部分可見，幾近穿孔，370組和440組角膜上皮多層愈合，基質內新生血管、瘢痕組織及纖維母細胞增生，炎性細胞較前減少。
　　6.三組實驗眼共焦顯微鏡結果:CXL后第1天，三組實驗眼潰瘍處基質層內均見大量炎性細胞，CXL后第7天，440組和370組實驗眼基質層內仍見大量炎性細胞，但少于對照組

14、實驗眼。CXL后第14天，440組和370組實驗眼基質層內炎性細胞較前減少，對照組仍見大量炎性細胞。
　　結論:
　　1.440nm藍光核黃素角膜交聯(lián)能有效控制金黃色葡萄球菌感染的角膜潰瘍。
　　2.440nm藍光核黃素角膜交聯(lián)治療細菌性角膜潰瘍療效與370nm紫外光A比較無顯著差異。
　　3.440nm藍光核黃素角膜交聯(lián)治療細菌性角膜潰瘍的安全性、遠期療效有待進一步研究。
　　4.440nm藍光核黃素角膜

15、交聯(lián)有望成為難治性角膜潰瘍的治療方法。
　　第二部分 440nm藍光聯(lián)合核黃素角膜交聯(lián)治療兔細菌性角膜炎的安全性研究
　　目的:
　　觀察440nm藍光核黃素角膜交聯(lián)治療兔細菌性角膜炎，對角膜內皮、視網膜、脈絡膜、鞏膜及視神經的影響，初步探討其治療細菌性角膜炎的毒副作用。
　　方法:
　　選取8只健康新西蘭大白兔，淺基質法制作金黃色葡萄球菌角膜潰瘍模型，每眼注射菌液0.08ml，余步驟同第一部分。24小時后

16、造模成功，全麻下進行440nm藍光核黃素角膜交聯(lián)，步驟同第一部分。于交聯(lián)治療后第1天、第7天分別氣栓處死4只兔子，摘取實驗眼眼球，其中各兩只放入4％多聚甲醛溶液中固定做病理切片，另四只眼球分別立即取下整個角膜，用錐蘭一茜素紅聯(lián)合染色法對角膜內皮進行染色觀察。
　　結果:
　　角膜交聯(lián)后第1天，角膜內皮染色未見異常，視網膜、脈絡膜、鞏膜及視神經病理組織切片未見異常。角膜交聯(lián)后第7天，角膜內皮染色未見異常，視網膜、脈絡膜、鞏膜及