長(zhǎng)鏈非編碼RNA ROR對(duì)胃癌干細(xì)胞增殖和侵襲能力以及特性的功能研究.pdf

1、第一部分胃癌干細(xì)胞的分選與鑒定，以及細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ROR的表達(dá)情況。
　　背景:胃癌是一種在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率位居第四位的惡性腫瘤，在我國(guó)腫瘤發(fā)病率中，胃癌位列第二，并且腫瘤死亡率中，胃癌位列第三，給人們的健康帶來(lái)了很大威脅。胃癌具有術(shù)后轉(zhuǎn)移、容易復(fù)發(fā)、耐藥等特性，而且至今還沒(méi)有研究出其調(diào)控機(jī)制，在這幾年中，腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)研究中，研究學(xué)者提出了腫瘤于細(xì)胞學(xué)說(shuō)。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為腫瘤起源于小部分具有自我更新和多種分化潛能的腫瘤細(xì)胞

2、，這部分細(xì)胞稱為腫瘤干細(xì)胞。目前，利用腫瘤干細(xì)胞表面特異的標(biāo)記分子分離和純化腫瘤干細(xì)胞的方法已較為普遍，并且有研究通過(guò)利用特異性的細(xì)胞表面標(biāo)志分子CD133，使用流式細(xì)胞儀從胃癌中成功分選出胃癌干細(xì)胞，并證明了CD133是胃癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志物。
　　目的:使用MKN-45細(xì)胞構(gòu)建胃癌干細(xì)胞細(xì)胞系，并檢測(cè)其中l(wèi)ncRNA ROR的功能。
　　方法:人MKN-45胃癌細(xì)胞用RMPI1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，制作單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)

3、胞濃度后加入CD133-FITC抗體進(jìn)行分選，孵育后使用流式細(xì)胞儀收集被CD133-FITC抗體標(biāo)記的細(xì)胞，即為CD133+ MKN-45細(xì)胞（簡(jiǎn)稱CD133+）;收集余下的未被CD133-FITC抗體標(biāo)記的細(xì)胞，即為CD133-MKN-45細(xì)胞（簡(jiǎn)稱CD133-）。并使用免疫熒光法檢測(cè)CD133+細(xì)胞中CD133與CD44v8-10的共表達(dá)定位情況;之后使用實(shí)時(shí)定量PCR法和免疫印跡法檢測(cè)CD133+和CD133-細(xì)胞中OCT4，SO

4、X2和NANOG等腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。之后，我們使用實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)CD133-和CD133+細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ROR的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并取患者胃癌組織標(biāo)本，分析其中l(wèi)ncRNA ROR和CD133表達(dá)量之間的關(guān)系。
　　結(jié)果:免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示，分選得到的CD133+細(xì)胞表面標(biāo)記物CD133與CD44v8-10有非常好的共定位，這提示我們分選得到的細(xì)胞為胃癌腫瘤干細(xì)胞;實(shí)時(shí)定量PCR法和免疫印跡法結(jié)果則顯示，與CD13

5、3-細(xì)胞相比，CD133+細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物OCT4，SOX2和NANOG等出現(xiàn)明顯的高表達(dá)，這進(jìn)一步驗(yàn)證了CD133+細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特質(zhì)。同時(shí)，CD133+細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ROR的表達(dá)量較CD133-顯著增多，并且患者的組織標(biāo)本分析也顯示lncRNA ROR與CD133+二者表達(dá)量呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)。
　　結(jié)論:通過(guò)流式細(xì)胞分選技術(shù)，我們使用MKN-45細(xì)胞成功構(gòu)建了胃癌腫瘤干細(xì)胞細(xì)胞系CD133+，并且測(cè)定胃癌干細(xì)

6、胞中l(wèi)ncRNA ROR表達(dá)顯著增高。
　　第二部分 lncRNA ROR對(duì)胃癌干細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡能力的影響
　　背景:近年來(lái)，lncRNA的研究領(lǐng)域如火如茶，長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非編碼R NA就稱之為lncRNA。而該類lncRNA是非編碼蛋白質(zhì)，所以在原來(lái)的研究中很多人的觀點(diǎn)是其為轉(zhuǎn)錄噪音。不過(guò)隨著研究水平的提高，發(fā)現(xiàn)lncRNA不管是表觀遺傳、翻譯水平、轉(zhuǎn)錄水平等各個(gè)層次中都能夠?qū)虮磉_(dá)產(chǎn)生調(diào)控影響，同時(shí)在多

7、種腫瘤中都有其身影。Loewer等人員還在研究中得出lncRNA ROR與一些干細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子存在著相互作用，在干細(xì)胞的重編程過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Dewi、Lagadec等研究則發(fā)現(xiàn)與誘導(dǎo)干細(xì)胞相似，腫瘤干細(xì)胞參與相同的重編程過(guò)程來(lái)維持腫瘤的生長(zhǎng)。KLF4和SOXl1這兩個(gè)基因與腫瘤干細(xì)胞的功能有關(guān)聯(lián)，并且這兩個(gè)基因與lncRNA ROR密切相關(guān)，因此lncRNA ROR可能是胃癌干細(xì)胞一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。綜上所述，探究lncRNA

8、ROR在胃癌干細(xì)胞中的功能勢(shì)在必行，這為將lncRNA ROR作為治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。
　　目的:探究lncRNA ROR對(duì)胃癌干細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡能力的影響。
　　方法:為了更好的探究lncRNA ROR在胃癌干細(xì)胞中的功能，我們將成功建立了lncRNA ROR的過(guò)表達(dá)系統(tǒng)以及敲低系統(tǒng)。我們將該過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CD133-細(xì)胞中，外源性過(guò)表達(dá)lncRNA ROR;同時(shí)，將能夠特異性抑制lncRNA ROR的siRNA轉(zhuǎn)

9、染至CD133+細(xì)胞中，敲低內(nèi)源性lncRNA ROR的表達(dá)。然后，在兩組中，我們使用MTT法和EdU摻入法檢測(cè)改變lncRNA ROR表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。隨后，在處理細(xì)胞24 h后，我們使用Transwell法檢測(cè)改變lncRNA ROR表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響。最后，我們利用流式細(xì)胞術(shù)使用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)改變lncRNA ROR表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡能力的影響。
　　結(jié)果:MTT法、EdU摻入法、Tr

10、answell法以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，在CD133-細(xì)胞中過(guò)表達(dá)lncRNA ROR能夠顯著提高細(xì)胞的增殖和侵襲能力，但對(duì)細(xì)胞凋亡能力影響并不大。與此相反，在CD133+細(xì)胞中抑制內(nèi)源性lncRNA ROR則能夠明顯抑制細(xì)胞的增殖和侵襲能力，并且能夠促進(jìn)細(xì)胞的凋亡能力。
　　結(jié)論:內(nèi)源性lncRNA ROR對(duì)胃癌干細(xì)胞增殖、侵襲以及抑制凋亡能力至關(guān)重要。
　　第三部分 lncRNA ROR能夠調(diào)控維持胃癌干細(xì)胞特性的轉(zhuǎn)

11、錄因子的表達(dá)
　　背景:研究結(jié)果顯示，干細(xì)胞基因的表達(dá)不正常，和惡性腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系。而且對(duì)于胃癌的出現(xiàn)、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中都有關(guān)鍵性影響。干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子會(huì)使得有關(guān)基因簇2(sex determining region Y-box2，SOX2)表達(dá)不正常時(shí)，致使胃粘膜上皮細(xì)胞分化失衡紊亂，引發(fā)腫瘤出現(xiàn);在細(xì)胞多能性的特點(diǎn)中，能夠維持該功能的標(biāo)志物是八聚體結(jié)合蛋白-4（octamer binding factor4，OCT4）

12、，該蛋白能夠和細(xì)胞分化有密切關(guān)系;Nanog與體細(xì)胞實(shí)體瘤的關(guān)系也日益受到關(guān)注，NANOG具有激發(fā)腫瘤形成的干細(xì)胞樣特性。因此，本研究以胃癌干細(xì)胞為研究對(duì)象，改變內(nèi)源性lncRNA ROR表達(dá)后，探討lncRNA ROR對(duì)維持胃癌干細(xì)胞特性的重要轉(zhuǎn)錄因子的作用，為胃癌的臨床治療和預(yù)后判斷提供可能的參考依據(jù)。
　　目的:探究lncRNA ROR對(duì)胃癌干細(xì)胞特性的影響。
　　方法:我們將該過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CD133-細(xì)胞中，外源

13、性過(guò)表達(dá)lncRNA ROR;同時(shí)，將能夠特異性抑制lncRNA ROR的siRNA轉(zhuǎn)染至CD133+細(xì)胞中，敲低內(nèi)源性lncRNA ROR的表達(dá)。然后，在兩組中，我們使用實(shí)時(shí)定量PCR法和免疫印跡法檢測(cè)維持胃癌干細(xì)胞特性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2和NANOG的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:實(shí)時(shí)定量PCR法和免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，在CD133-細(xì)胞中過(guò)表達(dá)lncRNA ROR能夠有效的上調(diào)OCT4、SOX2和NANOG的表達(dá)水平。