Annexin A4對結直腸癌EMT及侵襲轉移的影響.pdf

1、目的:結直腸癌(Colorectal Cancer，CRC)是一種較為常見的消化道惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率有明顯上升趨勢。結直腸癌的發(fā)病是一個牽涉到多基因、多步驟的復雜過程，因此其具體的發(fā)病機制仍不明確。膜聯(lián)蛋白(Annexins，ANX)家族是一種鈣依賴性磷脂結合蛋白的超家族。該家族不僅參與胞吞、胞吐、細胞凋亡以及細胞骨架構成等生理活動，而且在多種腫瘤的增殖、侵襲、轉移以及化療耐藥中也發(fā)揮了重要作用。Annexin A4是該家族里的一

2、員，近年來的研究顯示，膜聯(lián)蛋白A4(Annexin A4，ANXAⅣ，ANXA4)的表達失調、定位改變均與腫瘤密切相關，并可能與腫瘤的侵襲遷移有關，但其涉及的具體分子機制尚未清楚。本課題擬通過siRNA干擾技術沉默結直腸癌細胞中Annexin A4的表達，探討Annexin A4對結直腸癌細胞上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關分子的表達以及對腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移能力的影響，

3、進一步豐富Annexin A4在結直腸癌侵襲轉移過程中的分子機制。
　　方法:通過qRT-PCR法和Westem blot免疫印跡法檢測三種結直腸癌細胞系（SW480、 SW620、HT-29）中Annexin A4以及EMT相關的關鍵分子的表達情況，分析Annexin A4表達水平與結直腸癌EMT的關系，并篩選出適合本實驗研究的細胞系HT-29;采用siRNA技術干擾結直腸癌HT29細胞中Annexin A4的表達后再通過qRT

4、-PCR法和 Westem blot免疫印跡法檢測Annexin A4以及部分EMT相關重要分子（如:E-caderin、N-caderin等）表達水平的變化;采用siRNA技術干擾結直腸癌HT29細胞中Annexin A4的表達后，再通過MTT實驗和平板集落形成實驗檢測結直腸癌HT29細胞的增殖情況的變化，Transwell體外侵襲實驗檢測結直腸癌HT29細胞體外侵襲能力的改變，劃痕試驗檢測結直腸癌HT29細胞體外遷移能力的改變。

5、r>　　結果:1.qRT-PCR法檢測結果顯示Annexin A4 mRNA在正常結腸上皮細胞株NCM460中表達很低，而在結直腸癌SW620、SW480、HT29細胞株中Annexin A4 mRNA表達水平明顯增高，尤其以結直腸癌HT29細胞最為明顯;
　　2.Western Blot法檢測結果顯示結直腸癌HT29細胞株Annexin A4的表達水平相對于結直腸癌SW620、SW480細胞株表達最高，這與qRT-PCR法檢測的

6、結果一致;
　　3.qRT-PCR法和Western Blot法檢測結果顯示結直腸癌HT29細胞系上皮表型標志分子E-caderin分子表達明顯低于其他結直腸癌SW620、SW480細胞株，而間質表型特異性分子N-caderin分子表達明顯高于結直腸癌SW620、SW480細胞系;
　　4.siRNA技術干擾結直腸癌HT29細胞的Annexin A4表達后，qRT-PCR法檢測結果顯示siA4組結直腸癌HT29細胞內N-ca

7、ndherin、MMP9、MMP2、ZEB1、Snail、Slug和Vimentin表達水平低于siNC組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而E-candherin的表達水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001);
　　5.siRNA技術干擾結直腸癌HT29細胞的Annexin A4表達后，WesternBlot法檢測結果顯示siA4組結直腸癌HT29細胞的上皮細胞標志物E-cadherin的蛋白表達水平明顯高于siN

8、C組，而間充質細胞標志物N-caderin的蛋白水平明顯降低;
　　6.siRNA技術干擾結直腸癌HT29細胞的Annexin A4表達后，MTT實驗檢測結果顯示siA4組結直腸癌HT29細胞增殖速度較siNC組明顯降低((P＜0.01)，細胞克隆形成實驗檢測結果顯示siA4組細胞克隆形成數(shù)較siNC組明顯減少(P＜0.001)。
　　7.siRNA技術干擾結直腸癌HT29細胞的Annexin A4表達后，Transwell