PTPN1促進食管癌細胞侵襲運動的分子機制研究.pdf

1、PTPN1（Protein Tyrosine Phosphatase Non-receptor type1）是一種非跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶，主要通過調節(jié)細胞內蛋白酪氨酸磷酸化水平發(fā)揮功能，參與細胞增殖、生長和遷移的多個細胞信號通路的調節(jié)。研究表明，PTPN1在多種腫瘤組織中表達異常，并參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。我們在前期工作中發(fā)現PTPN1在食管癌組織中存在高表達，是CRT促進食管癌肺轉移的關鍵下游分子。本研究旨在進一步深入探討PTPN1促

2、進食管癌細胞侵襲運動的分子機制。
　　首先，我們通過在食管癌細胞中敲降PTPN1驗證了PTPN1可正向調控食管癌細胞的侵襲運動能力。同時，我們發(fā)現敲降PTPN1可降調EGFR表達和Erk1/2的活性。通過siRNA敲降EGFR和抑制劑抑制Erk1/2的活性，我們驗證了EGFR-Erk1/2通路對食管癌細胞侵襲運動能力的正向調控，并通過回復實驗證實了PTPN1主要通過激活EGFR-Erk1/2通路增強食管癌細胞的侵襲運動能力。接著，

3、我們通過Realtime PCR、MG132等實驗發(fā)現PTPN1主要在mRNA水平調控EGFR的表達，進一步的核質分離實驗和免疫熒光檢測表明PTPN1可促進EGFR的轉錄因子Sp1的漿核易位。
　　為深入研究PTPN1對EGFR-Erk1/2通路以及食管癌細胞侵襲運動能力的調節(jié)機制，我們通過GST Pull-down聯合LC/MS/MS技術高通量篩選了PTPN1在食管癌中潛在的相互作用蛋白共358個，并利用免疫共沉淀和免疫熒光技術

4、對其中的高分候選分子MYH9在食管癌細胞中和PTPN1的相互作用進行了驗證。MYH9為非肌型肌球蛋白重鏈ⅡA，參與細胞遷移、粘附及胞質分裂等多個過程，被報道與多個蛋白包括Sp1的異常定位相關，而其與PTPN1的相互作用尚未見文獻報道。
　　為確定MYH9的調控作用，我們在食管癌細胞中敲降MYH9，發(fā)現食管癌細胞的侵襲運動能力和EGFR的蛋白及mRNA水平顯著降低，并伴隨著Sp1的核漿易位。然而MYH9的ATPase抑制劑Blebb

5、istatin并不能影響食管癌細胞的侵襲能力和EGFR的表達，進一步的回復實驗證實MYH9的桿狀尾部在MYH9對EGFR的調控中起到關鍵作用。以上結果提示MYH9可能通過其桿狀尾部而不依賴其細胞骨架功能完整性介導PTPN1對食管癌細胞侵襲運動能力和EGFR蛋白表達的調控。
　　為進一步確定MYH9是否為PTPN1的關鍵下游分子，我們首先通過Phos-tag技術以及免疫沉淀法聯合廣譜酪氨酸磷酸化抗體檢測發(fā)現PTPN1可促進MYH9的

6、酪氨酸去磷酸化。結合數據庫信息，我們利用PTPN1底物捕獲突變體和MYH9桿狀尾部的非磷酸化突變體證實了PTPN1直接作用于MYH9的Y1408位點。接著，我們使用PTPN1的活性損傷突變體驗證了PTPN1通過其酪氨酸磷酸酶活性促進食管癌細胞的侵襲運動和EGFR的表達，并通過MYH9桿狀尾部的持續(xù)磷酸化突變體和非磷酸化突變體的回復實驗證實了MYH9桿狀尾部的Y1408非磷酸化形式在PTPN1促進EGFR表達中的關鍵作用。
　　本研