OAZ基因在K562細(xì)胞分化中的功能研究.pdf

1、多聚胺包括腐胺、亞精胺和精胺，幾乎是所有活細(xì)胞的必要組分。它們可以結(jié)合在RNA和染色體DNA上，在細(xì)胞周期、基因表達(dá)、細(xì)胞增殖與分化上起到重要的作用。多胺的缺失將導(dǎo)致細(xì)胞生長減慢甚至死亡，但是當(dāng)它們的含量升高時(shí)也會(huì)有致癌作用并且可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。鳥氨酸脫羧酶(ODC)是多聚胺生物合成中的限速酶，催化多聚胺生物合成途徑中的第一步：鳥氨酸向腐胺的轉(zhuǎn)變。ODC的半衰期僅僅幾分鐘，是已知所有酶中半衰期最短的。在多胺生成的過程中扮演著重要的調(diào)控酶

2、角色，其活性可在轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后水平被精確調(diào)控。鳥氨酸脫羧酶抗酶(OAZ)可以連接到ODC蛋白上，抑制其催化活性并靶向地促使26S蛋白酶降解ODC，在翻譯后水平影響ODC活性。此外，OAZ還能抑制細(xì)胞對多胺的吸收，促進(jìn)細(xì)胞對多胺的排泄，從而降低細(xì)胞內(nèi)多胺的濃度。研究表明細(xì)胞內(nèi)該抗酶的過度表達(dá)除了能降低細(xì)胞內(nèi)多胺水平，還能抑制細(xì)胞的生長。抗酶成員目前發(fā)現(xiàn)至少有三種，最主要的就是由227個(gè)氨基酸組成的抗酶1。抗酶1 C術(shù)端的部分是與ODC

3、結(jié)合的區(qū)域，N術(shù)端的部分則促進(jìn)ODC的降解?？姑? 未發(fā)現(xiàn)有通過蛋白酶體降解ODC的功能，但卻有抑制多胺轉(zhuǎn)運(yùn)的能力?？姑?，只存在于睪丸組織中，其表達(dá)特定的出現(xiàn)于精子細(xì)胞發(fā)生過程中，與生育有關(guān)。OAZ的表達(dá)需要有一個(gè)獨(dú)特的核糖體閱讀框的移位過程。所有的OAZ成員有兩個(gè)重疊的ORF框，一個(gè)帶有翻譯起始密碼子和在移位處的終止密碼子的ORF1，ORF2則編碼了大部分的0AZ多肽序列卻缺乏起始密碼子。因此翻譯全長的有功能的抗酶蛋白需要有+1的核

4、糖體移位，移位處的核苷酸序列高度保守，有助于從其它組織中對抗酶成員的鑒別。+1的移位過程受到精胺的誘導(dǎo)調(diào)控，機(jī)制尚不明晰。當(dāng)多胺水平上升時(shí)，可促進(jìn)核糖體移位，OAZ表達(dá)增多，于是反饋抑制細(xì)胞內(nèi)多胺濃度的上升。這樣的機(jī)制有助于防止細(xì)胞內(nèi)多胺濃度的起伏而造成的細(xì)胞毒性。許多實(shí)驗(yàn)已證實(shí)OAZ對ODC的降解作用與其對細(xì)胞的增殖抑制明顯相關(guān)，使其體現(xiàn)出抗腫瘤惡性增殖的特性。Ruchi M等發(fā)現(xiàn)在實(shí)體腫瘤細(xì)胞如肝癌和前列腺癌中，OAZ基因的表達(dá)升高

5、與細(xì)胞生長抑制明顯相關(guān)，通過與細(xì)胞周期素Dl(cyclinD1)結(jié)合并使之降解，使細(xì)胞停滯于G1期，減緩細(xì)胞生長。在鼠皮膚癌還有胃上皮癌的模型中，OAZ的過度表達(dá)均導(dǎo)致了癌細(xì)胞的生長抑制，提示OAZ基因在腫瘤細(xì)胞的治療上能發(fā)揮作用。我們的目的是通過定點(diǎn)突變技術(shù)，得到相應(yīng)的去除frameshift位點(diǎn)后的突變OAZ基因，并構(gòu)建至真核表達(dá)載體pEGFP-N1質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)染至K562細(xì)胞中，通過檢測K562細(xì)胞生長分化及cyclinDl基因變化

6、情況，來研究0AZ基因?qū)Π籽∧[瘤細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。K562細(xì)胞誘導(dǎo)分化：K562細(xì)胞是一株惡性程度較高的人紅白血病細(xì)胞系，建株于慢性淋巴細(xì)胞性白血病的患者。第九號(hào)與第22號(hào)染色體相互易位形成的Ph染色體是CML的腫瘤惡性克隆標(biāo)志。這種染色體平衡易位導(dǎo)致9q34上的c-abl原癌基因與22q11上的Bcr基因斷裂后重組，形成新的融合基因bcr-abl，后者轉(zhuǎn)錄翻譯的P21O蛋白具有異常增高的蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性。K562細(xì)胞具有

7、多項(xiàng)分化潛能并能被多種誘導(dǎo)物誘導(dǎo)分化，因此K562細(xì)胞成為一個(gè)重要的關(guān)于白血病研究的細(xì)胞模型。K562細(xì)胞能被誘導(dǎo)表達(dá)胚胎型和胎兒型的血紅蛋白，對這種機(jī)制的闡明有助于臨床上縑型紅細(xì)胞性貧血和B地貧的治療研究。當(dāng)前，對白血病治療的觀念正逐步從殺死白血病細(xì)胞向使其往良性方向分化轉(zhuǎn)變。許多化學(xué)物質(zhì)對K562細(xì)胞誘導(dǎo)分化的同時(shí)，會(huì)出現(xiàn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的副作用，如維甲酸、佛波酯、羥基脲均在誘導(dǎo)細(xì)胞分化同時(shí)出現(xiàn)促凋亡的現(xiàn)象。有研究發(fā)現(xiàn)OAZ在抑制細(xì)胞生

8、長的同時(shí)，被抑制細(xì)胞未出現(xiàn)凋亡的跡象，這給K562細(xì)胞的誘導(dǎo)分化研究提供了新的思路。 研究方法：通過熒光定量PCR技術(shù)檢測OAZ基因在Hernin誘導(dǎo)K562細(xì)胞紅系分化過程中的表達(dá)變化，結(jié)果說明OAZ的表達(dá)升高與K562紅系分化呈正相關(guān)。根據(jù)Gerlebank的數(shù)據(jù)，查找OAZ基因序列，并選用Primer primier5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增ORF2與OAz全長的引物。引物的5’端分別修飾上相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，以利于擴(kuò)增產(chǎn)物重組至表達(dá)載

9、體pET32a和pEGFP-N1。測序鑒定后命名為pET32a-OAZ-ORF2和pEGFP-N1-OAZ。將pET32a-OAZ-ORF2轉(zhuǎn)化至BL21菌，IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)出OAZ的ORF2部分蛋白。收集并純化蛋白后，免疫新西蘭兔，制備多克隆抗體。對測序鑒定后的pEGFP-N1-OAZ重組體，采用定點(diǎn)堿基突變技術(shù)，將框移位點(diǎn)處TCCTGATG的T堿基缺失，使OAZ基因的兩段開放閱讀框沒有重疊，無需精胺的誘導(dǎo)即可表達(dá)出全長OAZ蛋白，

10、減少實(shí)驗(yàn)過程中外源物質(zhì)的添加對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。測序后命名為pEGFP-N1-OAZ-mutation，并采用脂質(zhì)體法，轉(zhuǎn)染至K562細(xì)胞，G418篩選得到穩(wěn)定表達(dá)OAZ的細(xì)胞株，命名為K562<,OAZ>。同時(shí)針對OAZ基因序列，設(shè)計(jì)針對性的27mer siRNA，轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞和K562<,OAZ>細(xì)胞，抑制OAZ基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)中，我們采用熒光定量PCR技術(shù)檢測siRNA干擾OAZ基因表達(dá)的效率。當(dāng)OAZ在K562細(xì)胞中過表達(dá)及抑制

11、表達(dá)時(shí)，通過細(xì)胞生長檢測、分化檢測、細(xì)胞周期分析和cyclinDl基因變化檢測，初步探討OAZ在K562細(xì)胞生長分化中的功能。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：采用50mmol/L Hemin誘導(dǎo)K526細(xì)胞，細(xì)胞生長明顯減慢，聯(lián)苯胺陽性細(xì)胞增加，血紅蛋白數(shù)量增加，說明K562細(xì)胞被誘導(dǎo)向紅系方向分化。采用熒光定量PCR技術(shù)檢測OAZ基因表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)OAZ mRNA水平隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長表達(dá)量逐漸增多，OAZ在Hernin誘導(dǎo)24、48和72h后，

12、其mRNA表達(dá)分別上升了18.67％、51.12％和92.11％。為深入研究OAZ對K562的生物學(xué)效應(yīng)，我們構(gòu)建了OAZ突變基因重組質(zhì)粒，測序鑒定后，轉(zhuǎn)染至K562細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)隨時(shí)間的增加，細(xì)胞生長明顯減慢，聯(lián)苯胺陽性細(xì)胞增多。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生長受到抑制的K562細(xì)胞在G1期被阻滯，與cyclinDl的表達(dá)下凋相一致。為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可靠性，我們設(shè)計(jì)了針對OAZ基因的27mere siRNA，轉(zhuǎn)染K562<,OAZ>抑制OAZ基因的表達(dá)

13、。當(dāng)轉(zhuǎn)染siRNA 24h后，處理組OAZ基因較對照組的抑制率為46.04％，48h為55.41％，72t1為50.07％，說明siRNA的干擾效率可信。隨OAZ基因表達(dá)的減少，細(xì)胞的聯(lián)苯胺陽性率逐漸減少，由開始時(shí)的6.6％±1.0％分別下降4.3％±0.5％(24h)、4.1％±0.7％(48h)和4.6％±0.9％(72h)，細(xì)胞的增殖速度亦隨之增加，有逐步恢復(fù)惡性的趨勢。同時(shí)，RT-PCR檢測cyclinD1的表達(dá)也隨之增多，提示

14、細(xì)胞周期的抑制也隨之解除。 結(jié)論：(1)首次采用熒光定量PCR的方法檢測了OAZ基因在Hemin誘導(dǎo)K562細(xì)胞紅系分化時(shí)的表達(dá)變化，結(jié)果提示OAZ的表達(dá)增多與K562細(xì)胞的紅系分化呈正相關(guān)。(2)構(gòu)建了原核表達(dá)重組載體pET32a-OAZ-ORF2和真核表達(dá)重組載體pEGFP-N1-OAZ、pEGFP-N1-OAZ-mutation，并成功在BL21菌和K562細(xì)胞中表達(dá)。這對深入研究OAZ基因的功能提供了良好的研究基礎(chǔ)。(