FTIR及mapping技術探測陳舊性及急性心肌梗死的分子學差異.pdf

1、背景：心肌梗死（myocardiAlinfarction, MI）是心肌嚴重缺血所導致的心肌細胞壞死。MI是心肌缺血的嚴重并發(fā)癥之一，占所有死亡的10-15％，占猝死的60％。因此，MI作為心血管系統(tǒng)的重要病變之一，成為世界范圍內的健康隱患。
　　 依據病變時間差異，MI可分為急性心肌梗死（acute myocardiAlinfarction, AMI）及陳舊性心肌梗死（old myocardiAlinfarction, OMI

2、）。AMI往往表現為心肌細胞的溶解性壞死，心肌細胞腫脹，肌原纖維和細胞器廣泛溶解、消失，甚至只有核和胞膜的存留，整個心肌細胞猶如一個空鞘，同時細胞周圍出現纖維增生、變粗，形成網架結構。最終核消失，網架塌陷崩解；心肌細胞的再生能力極差，壞死區(qū)域最常見的修復形式為瘢痕形成，即壞死組織完全為膠原纖維所取代，纖維排列不規(guī)則。陳舊的瘢痕組織較致密，其膠原纖維可發(fā)生玻璃樣變性，或鈣鹽沉著，這就是OMI的主要病理學改變。從組織病理學角度，MI導致急性

3、炎癥，并且壞死組織逐漸被膠原瘢痕所取代，該過程大概需要6-8周時間。
　　 疾病的進程均為正常組織-微小病變-典型病變，早期AMI從組織病理學水平難以診斷，而且AMI向OMI發(fā)展過程中表現出來的組織病理學改變愈加復雜，難以進行有效的區(qū)分。在實際工作中，無論大體標本的宏觀觀察，還是組織切片的微觀觀察，所見到的病理改變往往比較復雜，單純依靠主觀的組織病理學檢查，往往難以對微小病變或輕度病變加以準確的區(qū)分和辨認。因此亟需尋找一種便捷、

4、敏感、可重復性的方法，以適用于法醫(yī)病理學鑒定的需要。
　　 傅立葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）技術興起于20世紀80年代，是確定分子組成和結構的有效技術工具，具有分析過程簡便、噪聲低、光通量高、測量速度快、波數精度高、頻率測量范圍寬、操作費用低、無損檢測等優(yōu)點，廣泛應用于化工、冶金、地礦、石油、醫(yī)藥、珠寶鑒定、法庭科學等諸多領域。對于固體、液體或氣體樣

5、本，單一組分的純凈物及多種組分的混合物都可以應用FTIR技術進行測定。FTIR既可以用于樣品的定性分析，也可用于定量分析。除此之外，FTIR檢測過程制樣簡單，生物樣本無需額外的染色技術，極大地縮短了測定時間。基于法醫(yī)病理學特定的保留樣本及復審需要，FTIR的無損性、可重復性尤為適用。
　　 當有機分子吸收紅外線后，會產生分子振動能級的躍遷，這種躍遷因不同有機分子的振動形式、振動方向及振幅大小而異，其振動能級躍遷有所差異，因此不同

6、結構的化合物在紅外線的照射下呈現出不同波長的吸收帶，即紅外光譜。FTIR即是將干涉圖應用數學上的傅立葉轉換所形成的紅外光譜。對于多原子的有機物來講，有些振動來自于整個分子，有些振動來自于分子局部的化學鍵或官能團，同一類型的化學鍵的振動具有相近的振動頻率。因此，FTIR依據分子共價鍵的不同運動方式所產生的紅外吸收的特征峰，來確定該化合物的化學結構或分子中的官能團特征。
　　 細胞由細胞膜、細胞質、細胞核構成，各部分主要化學組成為蛋

7、白質及脂質、糖原、核酸，這些組分的含量、構型及構象在不同組織細胞表現不同。在許多疾病過程中，這些組分會發(fā)生變化，而這些變化可以通過紅外光譜的差異表現出來。目前FTIR應用于腫瘤、動脈粥樣硬化斑塊、骨鈣化異常等疾病的分子特征進行研究，并發(fā)現了一些特征性的變化。國外學者曾利用MRI技術對活體內陳舊性心肌梗死及急性心肌梗死進行區(qū)別，但利用FTIR及面成像技術進行心肌梗死的分子特征測定并初步進行區(qū)分，目前國內外尚未見報道。
　　 本研究

8、突破傳統(tǒng)分子特征研究思路，在國際上首創(chuàng)性的聯用FTIR、紅外顯微鏡及面成像技術對心肌梗死的分子特征進行研究；將尸體樣本引入分子水平研究，在同一張切片上設定實驗組及對照組，消除了死后變化的影響；快速、敏感的對細胞各主要大分子成分的含量及空間構型進行同時分析，消除了單次分析一個指標的操作差異，并最大程度節(jié)省了檢測時間；在前期開創(chuàng)性工作的基礎上，對蛋白質、糖原、核酸及脂質等成分的變化關系進行探討，進一步用于探測陳舊性及急性心肌梗死的分子特征，

9、并為最終在分子水平區(qū)分陳舊性及急性心肌梗死奠定基礎。面成像技術的應用使得化學圖像能直觀的反映各大分子的分布及變化情況，并建立了與組織病理學的良好對應關系，延伸了“紅外病理學”這門交叉學科的涵蓋范圍。本研究屬于化學技術與法醫(yī)學研究的交叉性創(chuàng)新研究。
　　 目的：
　　 本研究針對現今法醫(yī)學心肌梗死的鑒定、陳舊性及急性心肌梗死的時間區(qū)分問題，通過將光譜學FTIR、紅外顯微鏡及面成像技術的聯合應用，對陳舊性及急性心肌梗死的分子

10、變化進行測定，主要探討紅外光譜反映出來的蛋白質、脂質、糖原及核酸的變化，以及相互之間的變化關系。并通過紅外化學圖像的特點，研究化學圖像與組織病理學的對應關系，為最終應用FTIR技術在分子水平上對陳舊性心肌梗死及急性心肌梗死加以區(qū)分奠定基礎。
　　 方法：
　　 實驗材料及儀器
　　 1999年-2008年本系檢案案例陳舊性心肌梗死及急性心肌梗死心臟樣本。
　　 傅立葉變換紅外光譜儀（Nicolet 670

11、0, Thermo Fisher Scientific，美國）；
　　 傅立葉變換紅外顯微鏡附件（Nicolet continuum microscope, Thermo Fisher Scientific，美國）；
　　 傅立葉變換紅外光譜儀（Nicolet iN10, Thermo Fisher Scientific，美國）；
　　 紅外光譜工作站（OMNIC 8.0，Thermo Fisher Scient

12、ific，美國）；
　　 虛擬顯微成像系統(tǒng)（Dotslide 2.1，Olympus，日本）；
　　 脫水機（AP-280X，Microm，德國）
　　 包埋機（STP-120，Microm，德國）；
　　 切片機（HM-340E，Microm，德國）；
　　 展片機（ZPJ-1，天津天利航空機電有限公司）；
　　 烤片機（KPJ-1，天津天利航空機電有限公司）；
　　 蘇木素、伊

13、紅、天然樹膠（上海試劑一廠）；
　　 二甲苯、乙醇、氨水、鹽酸（分析純）。
　　 實驗方法
　　 FTIR及紅外顯微鏡聯用檢測
　　 根據鑒定結果確定陳舊性心肌梗死部位，各心臟樣本在心肌梗死邊緣取材2塊，包括心肌梗死區(qū)及鄰近正常組織區(qū)。樣本常規(guī)制作蠟塊，行連續(xù)切片，厚6μm。將其中一張切片平鋪于普通載玻片上，行常規(guī)HE染色。將HE染色切片經Dotslide虛擬顯微成像系統(tǒng)在40分辨率下進行掃描，并依據病理

14、學改變設定心肌梗死病變區(qū)域為實驗組，同一張切片無明顯病變區(qū)域為對照組。另一張連續(xù)切片平鋪于表面鍍金的特殊載玻片上，此切片僅行常規(guī)脫蠟、脫水處理，不經任何染色方法處理，晾干行FTIR檢測。
　　 應用Nicolet 6700FTIR光譜儀、Nicolet continuum紅外顯微鏡（物鏡15×，目鏡10×）及其匹配工作站OMNIC 8.0檢測。反射模式，經液氮冷卻，在室溫24℃下進行，測定范圍為4000cm-1-650cm-1。

15、參數設置為單張光譜覆蓋面積為25μm×25μm，分辨率為4cm-1，掃描次數為32次。每個樣品在測試前先進行背景掃描，并儲存該光譜作為固定背景。根據HE染色切片劃分對照組及實驗組，在紅外顯微鏡指導下將相同區(qū)域劃分為對照組（A組）及實驗組（B組），各組隨機選取10個檢測區(qū)域，所采集光譜經OMNIC 8.0工作站存儲并處理分析。應用OMNIC軟件對光譜進行自動基線校正、自動平滑處理后，分析蛋白質酰胺、脂質、糖原、核酸等譜帶的峰位、峰強度，及

16、部分特征性譜帶的峰高比，以詮釋陳舊性心肌梗死及急性心肌梗死的分子特征，并建立與組織病理學的對應關系。
　　 FTIR、紅外顯微鏡及面成像（mapping）技術聯用檢測
　　 切片樣本制樣過程同上。聯用Nicolet iN10FTIR光譜儀、Nicolet continuum紅外顯微鏡（物鏡15×，目鏡10×）及其匹配工作站OMNIC 8.0檢測。反射模式，經液氮冷卻，在室溫24℃下進行，測定范圍為4000cm-1-650

17、cm-1。參數設置為單張光譜覆蓋面積為100μm×100μm，分辨率為16cm-1，掃描次數為1次。背景采集及分組同上。對整張切片組織進行掃描采集化學圖像。應用OMNIC Picta對化學圖像進行自動基線校正、自動平滑處理，并研究其與形態(tài)學的對應關系。
　　 統(tǒng)計學分析及圖像處理
　　 所得數據經SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學一維方差分析，以均數±標準差表示，P<0.05具有統(tǒng)計學差異。
　　 結果：
　　

18、 FTIR及紅外顯微鏡檢測
　　 在陳舊性心肌梗死病變區(qū)，蛋白質酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ各譜帶變化趨勢一致，均為峰位藍移、峰強度增加。脂質CH3反對稱及對稱伸縮振動、CH2反對稱及對稱伸縮振動譜帶變化趨勢一致，均為峰位無移動、峰強度增加。核酸PO2反對稱伸縮振動譜帶的峰位出現藍移，但對稱伸縮振動譜帶的峰位無移動，峰強度均降低。糖原C-O伸縮振動譜帶的峰位無移動、峰強度降低。I1652/I1634、I1650/I1550比值均增高；I

19、1550/I3300、I1160/I1080比值均降低；I2920/I2960比值無變化。
　　 在急性心肌梗死病變區(qū)，蛋白質酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ各譜帶變化趨勢一致，均為峰位無移動、峰強度降低。脂質僅CH3反對稱伸縮振動譜帶的峰位出現紅移、峰強度降低，其余CH3對稱、CH2反對稱及對稱伸縮振動各譜帶變化趨勢一致，均為峰位無移動、峰強度降低。核酸PO2反對稱伸縮振動譜帶的峰位無移動，而PO2對稱伸縮振動譜帶的峰位紅移，兩譜帶的峰強度

20、均降低。糖原C-O伸縮振動譜帶的峰位無移動、峰強度降低。I1652/I1643比值降低；I1650/I1550比值增高；I1550/I3300、I2920/I2850、I1160/I1080均無變化。
　　 FTIR及mapping檢測
　　 面掃描成像技術采集的化學圖像基本可以反映MI各大分子分布特征，并且與陳舊性心肌梗死的組織病理學分布特征基本一致，與急性心肌梗死的組織病理學分布特征較一致。應用數學模型一階導數、二階