調(diào)控性RNAi系統(tǒng)構建及靶向誘導腫瘤干細胞凋亡對抗腫瘤免疫機制影響研究.pdf

1、第二軍醫(yī)大學碩士學位論文調(diào)控性RNAi系統(tǒng)構建及靶向誘導腫瘤干細胞凋亡對抗腫瘤免疫機制影響研究姓名：劉淑鵬申請學位級別：碩士專業(yè)：遺傳學指導教師：孫樹漢20100501第二軍醫(yī)大學碩士學位論文RNA干擾(RNAi)是一種通過特定寡核苷酸序列靶向降解細胞中互補mRNA，進而抑制基因在體內(nèi)和體外的表達的技術?，F(xiàn)在廣泛應用的質(zhì)?；虿《据d體表達siRNA的方法，無法控制基因表達的空間及時間的特異性。這導致了各種調(diào)控表達系統(tǒng)的構建，應用最廣泛的是

2、Tet調(diào)控表達系統(tǒng)。基于以上基礎，我們進行了以下研究：第一部分，改建tet調(diào)控表達系統(tǒng)。根據(jù)購自Clontech公司的Tcton調(diào)控表達系統(tǒng)，在pTetOnAdvancedVector、pTREtightvector、pEGFPN1(AgeI位點突變?nèi)笔?及pLKOIpuro質(zhì)粒的基礎上構建單一質(zhì)粒的四環(huán)素調(diào)控表達質(zhì)粒pEGFPTctonTREsh。利用此質(zhì)粒進行了后續(xù)的靶基因Oct4的RNAi干擾實驗，并篩選了穩(wěn)定轉染細胞株。提高了體

3、內(nèi)實驗過程中RNAi的干擾效率。第二部分在實驗室前期工作的基礎上，檢測RNAi技術靶向Oct4誘導腫瘤干細胞凋亡后，免疫狀態(tài)的改變。在試驗中我們發(fā)現(xiàn)，利用RNAi技術干擾Oct4表達致使腫瘤干細胞數(shù)目減少后，腫瘤微環(huán)境中IL4，ILl0和TGF13減少。為了進一步確認這是否導致腫瘤微環(huán)境中腫瘤免疫反應增強，利用流式技術檢測腫瘤浸潤DC、CD4T及CDST細胞情況。發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞減少后，腫瘤浸潤的DC中matureDC的比例增加，CD4C