轉(zhuǎn)基因油菜轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)技術(shù).pdf

1、根據(jù)我國(guó)法律，未經(jīng)安全評(píng)價(jià)的油菜產(chǎn)品不容許進(jìn)口和在我國(guó)種植。進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化的轉(zhuǎn)基因品種需要建立檢測(cè)和監(jiān)測(cè)方法。2004年，我國(guó)允許拜耳公司研發(fā)的6個(gè)轉(zhuǎn)基因油菜品種(MS1×RF1、MS1×RF2、MS8×RF3、OXY235、Topas19/2和T45)和孟山都公司研發(fā)的1個(gè)轉(zhuǎn)基因油菜品種RT73(GT73)作為加工原料進(jìn)口。對(duì)轉(zhuǎn)基因油菜及其產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)和監(jiān)測(cè)是實(shí)施轉(zhuǎn)基因油菜安全管理的關(guān)鍵。隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定量標(biāo)識(shí)制度出臺(tái)，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定性、

2、定量檢測(cè)方法的研究顯得十分迫切和重要。本實(shí)驗(yàn)以德國(guó)拜耳公司培育的6個(gè)轉(zhuǎn)基因品種(MS1×RF1、MS1×RF2、MS8×RF3、OXY235、Topas19/2和T45)為實(shí)驗(yàn)材料，采用基因組步移法研究了轉(zhuǎn)基因油菜品系MS1、RF1、RF2、MS8、RF3、OXY235、Topas19/2和T45的外源基因插入位點(diǎn)序列特征，并根據(jù)插入DNA與基因組DNA的融合序列信息建立了MS1、RF1、RF2、MS8、RF3、OXY235、Topas

3、19/2和T45轉(zhuǎn)化事件特異性定性、定量檢測(cè)方法。并且對(duì)每個(gè)檢測(cè)體系的特異性、靈敏度、重復(fù)性、準(zhǔn)確性及可靠性進(jìn)行了驗(yàn)證。 1.MS1右邊界(5'端)旁側(cè)序列片段大小為1165bp，特異性引物MS1RG/MS1RV擴(kuò)增片段大小為141bp，檢測(cè)靈敏度為2.5個(gè)拷貝(0.013％)，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)R2值為0.995，LOD(limitofdetection)和LOQ(limitofquantification)分別為2.5個(gè)

4、拷貝和25個(gè)拷貝。 2.RF1左右邊界(3'和5'端)旁側(cè)序列片段大小分別為1592bp、3192bp，定性引物RF1RG/RF1RV和RF1LG-F/RF1LV-R擴(kuò)增片段大小為99bp、284bp，檢測(cè)靈敏度均為5個(gè)拷貝(0.013％)，定量引物RF1RG/RF1RV和RF1LG/RF1LV擴(kuò)增片段大小為99bp、117bp，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)R2值分別為0.996和0.988，LOD值均為5個(gè)拷貝；LOQ為25個(gè)拷貝。

5、 3.RF2右邊界(5'端)旁側(cè)序列片段大小為2978bp，特異性引物對(duì)RF2RG/RF2RV擴(kuò)增片段大小為138bp，檢測(cè)靈敏度為5個(gè)拷貝(0.013％)，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)R2值為0.998，LOD和LOQ分別為5個(gè)拷貝和25個(gè)拷貝。 4.MS8右邊界(3'端)旁側(cè)序列片段大小為907bp，特異性引物Ms8RG/Ms8RV擴(kuò)增片段大小為123bp，檢測(cè)靈敏度為2.5個(gè)拷貝(0.013％)，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)R

6、2值為0.991，LOD和LOQ分別為20個(gè)拷貝和25個(gè)拷貝。 5.RF3右邊界(3'端)旁側(cè)序列片段大小為694bp，特異性引物Rf3RG/Rf3RV擴(kuò)增片段大小為92bp，檢測(cè)靈敏度為50個(gè)拷貝(0.13％)，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)R2值為0.995，LOD和LOQ分別為20個(gè)拷貝和25個(gè)拷貝。 6.OXY235左右邊界(5'和3'端)旁側(cè)序列片段大小分別為923bp、1109bp，特異引物OXYLG/OXYLV和O

7、XYRG/OXYRV擴(kuò)增片斷大小發(fā)分別為105bp，124bp，檢測(cè)靈敏度分別是100個(gè)拷貝(0.13％)和10個(gè)拷貝(0.013％)。建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)R2分別為1.000和0.998，LOD值均為10個(gè)拷貝或接近10個(gè)拷貝；LOQ值均為50個(gè)拷貝。 7.Topas19/2左邊界(3'端)旁側(cè)序列片段大小為823bp，特異性引物TOPLG/TOPLV擴(kuò)增片段大小為110bp，檢測(cè)靈敏度為10個(gè)拷貝(0.013％)，建立的標(biāo)

8、準(zhǔn)曲線決定系數(shù)R2值為0.995，LOD和LOQ分別為5個(gè)拷貝和50個(gè)拷貝。 8.T45左右邊界(3'端和5'端)旁側(cè)序列片段大小分別為2154bp、1616bp，根據(jù)分離的左右邊界(3'端和5'端)設(shè)計(jì)特異引物T45LG/T45LV和T45RG/T45RV，擴(kuò)增片斷大小分別為107bp，117bp。用根據(jù)右邊界(5'端)設(shè)計(jì)的引物對(duì)T45RG/T45RV擴(kuò)增低拷貝模板時(shí)，熒光信號(hào)迅速衰減。選用引物對(duì)T45LG/T45LV建立定