OsDREB3轉(zhuǎn)基因大豆品系特異性檢測方法的研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因食品的安全性及對生態(tài)環(huán)境的影響等問題一直是關(guān)注的焦點。目前商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因大豆主要為抗草甘膦大豆，抗逆基因的轉(zhuǎn)基因大豆因地理環(huán)境及全球商業(yè)化的需求的增多，商業(yè)化的呼聲也越來越高，但迄今為止我國尚未建立抗逆轉(zhuǎn)基因大豆的檢測技術(shù)。
　　 本實驗以已進(jìn)入環(huán)境釋放或生產(chǎn)性試驗、或獲得安全證書的轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全評價階段的耐低溫抗逆轉(zhuǎn)基因大豆新品系轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB3為研究對象，利用染色體步移技術(shù)，獲得了轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB35

2、’端和3’端旁側(cè)序列信息。通過生物信息學(xué)分析方法明確了5’端旁側(cè)序列344bp覆蓋了轉(zhuǎn)化載體及轉(zhuǎn)基因大豆基因組，在大豆基因組為1號染色體，位置為49，828，108～49，836，357；3’端旁側(cè)序列共長2189bp，屬未知基因序列。
　　 本實驗根據(jù)已得到的5’端旁側(cè)序列信息，建立了轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB3品系特異性定性和定量檢測方法。品系特異性檢測定性和定量引物所擴(kuò)增片段覆蓋了大豆基因組及轉(zhuǎn)化載體序列信息，在檢測過程中隨機(jī)

3、選擇了4種轉(zhuǎn)基因大豆，2種轉(zhuǎn)基因玉米，2種轉(zhuǎn)基因水稻同時進(jìn)行品系特異性定性及定量檢測，結(jié)果顯示除轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB3有擴(kuò)增片段或擴(kuò)增曲線外，其余轉(zhuǎn)基因作物均沒有擴(kuò)增片段或擴(kuò)增曲線，表明該定性及定量檢測方法符合品系特異性檢測要求。定性檢測擴(kuò)增片段大小為160bp。檢測靈敏度為0.1％，比歐盟檢測下限(0.9％)低，且重現(xiàn)性好，可用于轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB3定性檢測。所設(shè)計的熒光定量：PCR引物，擴(kuò)增曲線檢測下限可達(dá)0.01％。

4、　　 建立了轉(zhuǎn)基因大豆多重PCR檢測方法和轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB3巢式PCR檢測方法。本實驗選擇了轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12及轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB3DNA作為待檢測基因模板，對多重PCR體系中的成分進(jìn)行了多次調(diào)整，嘗試了多種不同引物對的配比，擴(kuò)增片段大小相差100多個堿基，范圍從700bp～200bp之間，可視性好。最終確定了最佳檢測方案，成功實現(xiàn)了3種轉(zhuǎn)基因大豆、4組不同片段的同時擴(kuò)增和檢測，檢測下限

5、可達(dá)0.01％。巢式PCR所用引物在滿足品系特異定性檢測的同時，也要提高其檢測的靈敏度，本實驗所建立巢式PCR檢測方法，檢測靈敏度可達(dá)0.005％。
　　 本實驗在原有構(gòu)建有4種轉(zhuǎn)基因大豆品系特異性序列的標(biāo)準(zhǔn)分子的基因上又構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB3品系特異性序列，新構(gòu)建的含有5種轉(zhuǎn)基因大豆品系特異性序列及大豆內(nèi)參基因lectin的陽性對照標(biāo)準(zhǔn)分子，本實驗通過實時熒光定量PCR方法，以大豆凝集素基因(lectin)作為內(nèi)源參照

6、基因，確定了外源基因OsDREB3在轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB3基因組為單拷貝作物。
　　 本實驗希望通過染色體步移技術(shù)得到的OsDREB3外源基因旁翼序列，建立起來的轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB3一整套靈敏高、重現(xiàn)性好、可信度高、特異性強(qiáng)的品系特異性檢測體系，充分提高了轉(zhuǎn)基因大豆檢測工作效率，從而完善了現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)分子在OsDREB3抗旱基因檢測方面的不足，為我國建立轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB3標(biāo)識管理制度提供參考。該方法為建立轉(zhuǎn)基因