Reptin在胃癌發(fā)生發(fā)展中作用的初步研究.pdf

1、胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其致死率高居全球腫瘤相關致死率的第二位。中國是胃癌高發(fā)區(qū)，目前胃癌已成為中國第三大常見腫瘤，胃癌被發(fā)現(xiàn)時往往已經(jīng)是晚期，且常伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移、腹腔種植性轉(zhuǎn)移等，患者預后不良，五年生存率很低。因此，揭示胃癌的發(fā)生發(fā)展機制，尋找有效的藥物靶點對于干預和阻斷胃癌的發(fā)生發(fā)展具有重要的理論價值和臨床意義。
　　 Reptin是AAA+ATP酶家族成員之一，具有多種生物學活性，如構成染色質(zhì)重塑復

2、合體、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、參與DNA損傷修復和調(diào)節(jié)端粒酶活性等。研究發(fā)現(xiàn)，Reptin的異常表達與腫瘤形成密切相關。研究顯示，Reptin在結(jié)直腸癌，肝細胞肝癌，膀胱癌，非小細胞肺癌，以及各種急慢性白血病中過度表達，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。然而，Reptin在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不明確。本研究即初步探討了Reptin在胃癌發(fā)生和進展過程中的作用。
　　 目的:通過研究Reptin在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，探討胃癌的發(fā)生機制

3、，豐富我們對Reptin致癌機制的認識。
　　 方法:
　　 1.在組織水平上，用免疫組織化學染色的方法檢測了40例胃癌及癌旁胃粘膜組織標本中Reptin的表達水平，并確定Reptin在胃癌及癌旁胃組織中表達的差異性。
　　 2.在胃癌細胞系BGC823和MGC803中轉(zhuǎn)染ReptinsiRNA和ControlsiRNA后，檢測衰老相關的β-半乳糖苷酶(SA-β-Galstaining)，觀察細胞衰老情況。另一部

4、分細胞提取總RNA和總蛋白，分別做QRT-PCR和Westernblotting檢測ReptinmRNA水平及蛋白水平的表達，驗證干擾效果。
　　 3.在胃癌細胞系AGS，BGC823和HGC27中轉(zhuǎn)染ReptinsiRNA和ControlsiRNA后，從每種處理組中取300個細胞常規(guī)培養(yǎng)10天，觀察細胞形成的克隆，染色并計數(shù)，比較細胞形成克隆的能力，評價Reptin對胃癌細胞克隆形成能力的作用。
　　 4.在胃癌細胞系

5、BGC823和MGC803中轉(zhuǎn)入ReptinsiRNA和ControlsiRNA后，取5×104個細胞進行Transwell基質(zhì)膠侵襲實驗，穿過小室的細胞行結(jié)晶紫染色并鏡下計數(shù)，分析Reptin對胃癌細胞體外侵襲能力的影響。
　　 5.在胃癌細胞系BGC823和MGC803中轉(zhuǎn)染ReptinsiRNA和ControlsiRNA后，分別提取細胞總RNA，和提取細胞蛋白，分別作RT-PCR、QRT-PCR及Westernblotti

6、ng檢測Reptin對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關分子E-cadherin、Vimentin、和Snail表達的影響。
　　 6.將轉(zhuǎn)染ReptinsiRNA及ControlsiRNA的BGC823細胞分別皮下注入裸鼠體內(nèi)，觀察裸鼠皮下腫瘤的形成和生長情況。4周后麻醉處死裸鼠，分離腫瘤組織，凍于-80℃冰箱用于檢測ReptinmRNA的表達。
　　 7.將轉(zhuǎn)染ReptinsiRNA及ControlsiRNA的BGC823細胞分別經(jīng)

7、尾靜脈注入裸鼠體內(nèi)，5周后麻醉處死裸鼠，解剖肺臟，清洗后電子天平稱肺質(zhì)量，并觀察肺表面及實質(zhì)內(nèi)形成的轉(zhuǎn)移灶情況。肺組織用中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟切片，進行HE染色，以備組織病理學檢查。
　　 結(jié)果:
　　 1.組織水平檢測中，Reptin在胃癌組織中的表達明顯高于正常胃粘膜組織中的表達。
　　 2.QRT-PCR和Westernblotting顯示，轉(zhuǎn)染ReptinsiRNA的人胃癌細胞BGC823和MGC80

8、3中ReptinmRNA和蛋白表達明顯降低。衰老相關的β-半乳糖苷酶染色表明，在胃癌細胞系BGC823和MGC803中干擾Reptin表達后，細胞出現(xiàn)明顯的衰老現(xiàn)象。
　　 3.克隆形成實驗表明，在胃癌細胞系AGS，BGC823和HGC27中轉(zhuǎn)入ReptinsiRNA72小時后，細胞的克隆形成能力受到顯著抑制。
　　 4.Transwell實驗中，轉(zhuǎn)染ReptinsiRNA的人胃癌細胞BGC823和MGC803相比于對照

9、組侵襲到下層的細胞數(shù)顯著減少。
　　 5.將ReptinsiRNA轉(zhuǎn)染人胃癌細胞BGC823和MGC803后，RT-PCR和QRT-PCR檢測結(jié)果顯示，干擾Reptin表達后，Vimentin及Snail的mRNA水平顯著降低，E-cadherin則無明顯變化。Westernblotting檢測顯示E-cadherin的蛋白水平有所升高，Vimentin和Snail的蛋白水平顯著降低。
　　 6.裸鼠皮下成瘤實驗中干擾R

10、eptin的BGC823細胞相對于對照細胞在裸鼠皮下形成腫瘤的能力明顯降低，腫瘤的體積明顯減小。QRT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染ReptinsiRNA組裸鼠腫瘤組織中的ReptinmRNA水平明顯降低。
　　 7.裸鼠尾靜脈注射腫瘤細胞實驗中，干擾Reptin的BGC823細胞在裸鼠肺表面及實質(zhì)內(nèi)形成的轉(zhuǎn)移灶明顯少于對照組。HE染色鏡下可見轉(zhuǎn)染ReptinsiRNA組瘤體較小;而對照組瘤體較大。
　　 結(jié)論:
　　 R

11、eptin在胃癌組織中的表達明顯高于其在癌旁胃粘膜組織中的表達。在胃癌細胞系中降低Reptin的表達可誘導細胞出現(xiàn)明顯的衰老現(xiàn)象，顯著抑制細胞的克隆形成能力和胃癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。并且抑制Reptin的表達顯著降低了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關分子Vimentin和SnailmRNA及蛋白水平的表達，并能夠明顯升高上皮細胞標志分子E-cadherin的蛋白表達。以上在胃癌細胞系中進行的體外實驗提示，Reptin能夠通過影響以上生物學行為促進胃癌