胃癌細胞miRNAs表達譜的建立及miR-29c在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、【研究背景和目的】胃癌是最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和病死率均居惡性腫瘤前列,在我國居消化道惡性腫瘤發(fā)病率的首位。胃癌的早期診斷和治療一直是臨床難點所在,尤其是中晚期無法手術(shù)及伴有遠處轉(zhuǎn)移的患者。因此,深入研究胃癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的機制有助于更好地診斷和治療。
  microRNA(miRNA或miR)是一類真核生物內(nèi)源性的具有重要調(diào)節(jié)作用的小分子單鏈RNA,在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行調(diào)節(jié),參與細胞的生長、分化、凋亡等生命活動。

2、研究表明,miRNA與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥等病理進程密切相關(guān),miRNA可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
  為此,本研究收集胃癌細胞和正常胃黏膜細胞,通過miRNA寡核苷酸芯片技術(shù),篩選胃癌可能相關(guān)的差異miRNAs,建立胃癌細胞miRNAs表達譜。進一步采用實時熒光定量PCR(Q-PCR)方法對差異miRNAs進行篩選和驗證,以期發(fā)現(xiàn)在胃癌細胞和胃癌組織中表達相一致的胃癌相關(guān)miRNAs,作為候選的在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中起重

3、要作用的miRNAs,以便進一步研究其在胃癌進程中的影響。
  【材料與方法】收集9株胃癌細胞和6例正常胃黏膜細胞,抽提總RNA,采用miRNA寡核苷酸芯片,檢測胃癌細胞和正常胃黏膜中的miRNAs表達譜,比較并篩選出具有顯著差異的miRNAs。采用Q-PCR方法驗證由芯片篩選出的差異miRNAs在胃癌細胞和正常胃黏膜中的表達情況,并收集40對胃癌組織樣本檢測這些差異miRNAs的表達。篩選出在胃癌細胞和胃癌組織中表達相一致的胃癌

4、相關(guān)miRNAs,其中包括miR-29c。采用miR-29c precursor或miR-29c逆轉(zhuǎn)錄病毒過表達載體上調(diào)胃癌細胞SGC-7901中miR-29c的表達水平,觀察其過表達對胃癌細胞增殖、凋亡、遷移能力和裸鼠皮下腫瘤生長能力等生物學(xué)行為的影響來研究miR-29c在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。并利用生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-29c的靶基因,結(jié)合雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)、Q-PCR和Western blot檢測方法,驗證NASP為miR

5、-29c的靶基因,初步明確miR-29c發(fā)揮生物學(xué)功能的分子機制。
  【結(jié)果】在miRNA寡核苷酸芯片篩選的566個人類miRNAs中,通過比較胃癌細胞和正常胃黏膜中miRNAs的表達譜,發(fā)現(xiàn)46個miRNAs有顯著差異,其中17個miRNAs顯著上調(diào)(LogRatio>1.0),29個miRNAs顯著下調(diào)(LogRatio<-5.0)。利用這46個差異miRNAs進行聚類分析,能較好地將胃癌細胞和正常胃黏膜區(qū)分開來。由于引物商

6、品化等原因,我們合成了41個miRNAs的引物(其中包括15個上調(diào)的miRNAs和26個下調(diào)的miRNAs),進入下一步的Q-PCR驗證。
  比較上述miRNAs在9株胃癌細胞和6例正常胃黏膜及40對胃癌組織和配對癌旁組織中的表達情況,15個上調(diào)的miRNAs在胃癌細胞和胃癌組織中的表達情況與芯片結(jié)果的符合率分別為73.33%(11/15)和66.67%(10/15),26個下調(diào)的miRNAs分別為88.46%(23/26)和3

7、0.77%(8/26)。綜合以上結(jié)果,我們篩選出15個與胃癌相關(guān)的miRNAs,其中有8個上調(diào),分別為miR-196a,miR-196b,miR-18a*,miR-183,miR-18a,miR-106a,miR-186和 miR-93;7個下調(diào),分別為 miR-451,miR-495,miR-409-3p,miR-497,miR-133b,miR-136和miR-29c。
  以上15個miRNAs作為胃癌相關(guān)miRNAs,可能

8、在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中起相當重要的作用。在此課題中,我們主要關(guān)注了miR-29c在胃癌中的生物學(xué)功能。研究表明,上調(diào)miR-29c的表達水平能有效抑制胃癌細胞SGC-7901體外增殖、克隆形成及遷移能力,并誘導(dǎo)細胞凋亡,體內(nèi)實驗表明,過表達 miR-29c能抑制胃癌細胞SGC-7901裸鼠皮下腫瘤生長能力。
  生物信息學(xué)分析提示NASP3’UTR含有miR-29c作用的靶序列,雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測進一步驗證了NASP是mi

9、R-29c的直接靶基因,Q-PCR及Western blot證實miR-29c對NASP表達的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。
  【結(jié)論】miRNA寡核苷酸芯片篩選出的差異miRNAs構(gòu)成的miRNAs表達譜能將胃癌細胞與正常胃黏膜較好地區(qū)分開來。miR-29c在胃癌細胞和胃癌組織中顯著下調(diào),能抑制胃癌細胞SGC-7901體外增殖、克隆形成及遷移能力,并誘導(dǎo)細胞凋亡,體內(nèi)實驗表明,過表達miR-29c能抑制胃癌細胞SGC-7901裸鼠皮下

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