脂肪源性干細胞對大鼠坐骨神經損傷修復作用及其相關機制的研究.pdf

1、周圍神經損傷后的修復是外科領域的一大難題。現(xiàn)代化交通和工業(yè)的迅速發(fā)展以及重大的自然災害都是周圍神經損傷的重要因素,發(fā)生率越來越高的周圍神經損傷給人們的日常生活帶來巨大痛苦并給社會帶來巨大的經濟負擔。較小的神經缺損可作端-端縫合,較大的缺損無法做端-端吻合則需要用移植物代替。但是后者存在很多缺點,如需要多次手術、犧牲健康神經并造成供體部位的功能缺失。如今,組織工程技術的發(fā)展為治療周圍神經缺損提供了新的策略。
　　 因為具有自我增殖

2、速度快并且具有多向分化潛能的特征,間充質干細胞(Mesenchymal stem cells,MSC)成為一種十分具有吸引力的組織工程種子細胞來源。大量實驗表明,骨髓來源的間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymalstem cell,BMMSC)能夠促進周圍神經再生。同時,有研究發(fā)現(xiàn)大鼠BMMSC表達神經營養(yǎng)因子(neurotrophic factor,NF),包括神經生長因子(NGF)、腦源性神經營養(yǎng)

3、因子(BDNF)、睫狀節(jié)神經細胞營養(yǎng)因子(CNTF)和膠質源性神經營養(yǎng)因子(GDNF),并且BMMSC促進周圍神經損傷修復的機制與神經營養(yǎng)因子有關。另一項研究也認為,BMMSC對腦損傷的保護作用主要是其神經營養(yǎng)因子的合成。
　　 然而,BMMSC的取材是一個高侵害的過程,并且骨髓中的間充質干細胞的比例相對較低,因此急需尋找它的替代來源。
　　 近年來,另外一種間充質干細胞一脂肪源性干細胞(adipose-derived

4、stem cell,ADSC)成為組織工程的研究熱點。與BMMSC相比,除了具有相似的表型和基因表達特征外,ADSC還具有其獨特的優(yōu)勢:①人類具有豐富的皮下脂肪,來源廣泛;②能夠通過安全的常規(guī)吸脂術獲得,取材方便;③脂肪組織中的間充質干細胞的比例高于骨髓;④ADSC增殖速度快于BMMSC。
　　 既然ADSC具有這些優(yōu)勢,是否可以說ADSC就是一種理想的神經組織工程種子細胞昵?有一系列問題擺在我們面前:①ADSC是否能夠合成和分

5、泌NF;②ADSC是否能夠促進周圍神經損傷的修復;③ADSC是否能在同種異體動物體內長時間存活;④如果ADSC能夠促進周圍神經損傷的修復,那么其機制可能是什么?
　　 目的：
　　 本實驗將在體外原代培養(yǎng)ADSC并在細胞水平檢測各種NF的表達情況,另外以ADSC為種子細胞,以脫細胞神經同種異體移植物(acellular nerve allografts,ANA)為支架構建組織工程神經應用到大鼠坐骨神經缺損模型,來觀察AD

6、SC是否具有促進神經再生的作用,并進一步探討其機制。
　　 實驗方法：
　　 一、ADSC的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 采用3-4周的雄性Wistar大鼠,從腹股溝獲得脂肪組織,應用酶消化法分離ADSC,并培養(yǎng)至第三代。
　　 取第三代ADSC分別在成骨誘導培養(yǎng)基和成脂誘導培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),觀察其形態(tài)的改變。茜素紅染色和油紅O染色分別鑒定ADSC向骨細胞和脂肪細胞分化的能力。
　　 二、ADSC和BM

7、MSC的增殖檢測
　　 應用噻唑藍(MTT)比色法,分別對第一代和第三代ADSC、BMMSC繪制生長曲線,對二者進行比較。
　　 三、ADSC細胞水平的檢測
　　 (一)神經營養(yǎng)因子(NF)
　　 應用RT-PCR和ELISA方法分別在mRNA和蛋白水平檢測ADSC神經營養(yǎng)因子的表達。
　　 (二)神經細胞粘附分子(NCAM)
　　 應用免疫細胞化學方法觀察ADSC是否表達NCAM。

8、>　　 四、組織工程神經的制備
　　 (一)ANA的制備
　　 Wistar大鼠,經麻醉后取出兩側的坐骨神經,采用化學萃取脫細胞方法制備ANA,作為神經組織工程支架。
　　 (二)移植細胞的標記
　　 應用PKH-26熒光染料標記ADSC。
　　 (三)組織工程神經移植物
　　 取標記后的ADSC,用微量注射器按照接種濃度為1×106/mL注入到脫細胞神經支架內并置于CO2培養(yǎng)箱內聯(lián)合培

9、養(yǎng)3天,備用。
　　 五、實驗動物、分組和手術
　　 雄性Wistar大鼠48只(200-250g,由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供)按照實驗設計分為3組,即DMEM組(支架內單純注射培養(yǎng)基)、ADSC組(支架內注射ADSC和培養(yǎng)基)和自體移植組。
　　 用長10mm組織工程神經橋接于大鼠右側坐骨神經10mm缺損處。自體移植組將切斷的1cm的神經翻轉180度過來縫合。
　　 六、檢測手術12周后坐骨神經功能恢

10、復情況
　　 (一)行為學檢測
　　 足跡實驗檢測大鼠坐骨神經功能指數(shù)(sciatic function index,SFI),觀察其神經功能恢復情況。
　　 (二)電生理檢測
　　 應用神經電圖儀描記電位,檢測神經傳導速度、潛伏期和波幅,從神經電生理角度觀察其功能恢復情況。
　　 (三)脛骨前肌濕重比
　　 檢測脛骨前肌濕重比,從其靶器官的角度觀察其功能恢復情況。
　　 (四)形

11、態(tài)學檢測
　　 甲苯胺藍染色觀察再生神經的有髓纖維數(shù)目、軸索直徑和髓鞘厚度,透射電鏡觀察髓鞘變性恢復情況。
　　 七、移植細胞的檢測
　　 12周時應用免疫組織熒光方法檢測移植物內PKH-26標記的ADSC發(fā)出的熒光信號,以確定移植細胞是否在宿主體內存活。
　　 八、神經移植物內NF的檢測
　　 應用RT-PCR法檢測術后3天和12周神經移植物內NF的表達,進一步探討ADSC促進周圍神經修復的機制

12、。
　　 九、統(tǒng)計學分析
　　 各組實驗重復三次。實驗數(shù)據(jù)以-x±S表示,應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析和處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結果：
　　 一、ADSC的多向分化能力
　　 ADSC具有成脂和成骨潛能揭示其干細胞的特征,并且ADSC比BMMSC增殖快。
　　 二、ADSC細胞水平特征
　　 ADSC表達NGF、BDNF、NT-3、GDNF、

13、CNTF和LIF等NF和NCAM。
　　 三、ADSC能夠促進坐骨神經再生
　　 ADSC能夠促進坐骨神經再生,通過以下方面證明:①足跡分析證明大鼠行為學方面的提高;②脛前肌濕重比的提高;③神經傳導速度和波幅的增加,潛伏期縮短;④移植物內有髓神經纖維數(shù)目、髓鞘厚度和軸索直徑的增加。
　　 四、ADSC的追蹤
　　 免疫熒光發(fā)現(xiàn)的PKH-26熒光信號提示在ADSC移植12周后在宿主體內存活。
　　

14、五、移植物內NF的表達
　　 在術后3天,在ADSC組神經移植物內檢測NF的表達,然而在DMEM組沒有檢測到。12周后,ADSC組的神經營養(yǎng)因子中BDNF、NT-3和GDNF表達高于DMEM組,具有統(tǒng)計學意義。
　　 結論：
　　 1、ADSC表達NF和NCAM,提示其具有促進神經再生的潛能。
　　 2、ADSC能夠在宿主組織內存活較長時間并且能夠促進神經再生,提示ADSC是一種理想的神經組織工程種子細胞