β3GnT8在結腸癌細胞株轉移中的分子機制及轉錄因子c-jun對β3GnT8的調控作用.pdf

1、目的：研究糖基轉移酶β3GnT8在結腸癌細胞侵襲轉移中的分子機制及探討轉錄因子c-jun對β3GnT8的轉錄調控作用。
　　方法：⑴Tranwell細胞遷移和侵襲實驗分別檢測LS-174T,SW620,SW480, LoVo四株結腸癌細胞的遷移和侵襲能力。⑵Western-blot檢測β3GnT8和CD147在四株結腸癌細胞中的蛋白表達水平。⑶流式細胞術和Lectin-blot檢測四株結腸癌細胞株中多聚乳糖胺鏈的表達水平。⑷將β3

2、GnT8的真核正義表達載體及空載體、β3GnT8干擾載體及對照載體通過脂質體分別介導轉染至低轉移的結腸癌細胞株LS-174T和高轉移的結腸癌細胞株LoVo。⑸Western-blot檢測轉染后LS-174T中β3GnT8上調后和LoVo細胞中β3GnT8下調后CD147糖基化的改變。⑹Tranwell細胞遷移和侵襲實驗檢測轉染后LS-174T中β3GnT8上調后和LoVo中β3GnT8下調后,其細胞遷移和侵襲能力的變化。⑺克隆轉錄因子c

3、-jun全長基因序列并構建c-jun正義表達載體。⑻將c-jun真核正義表達載體及空載體通過脂質體轉染胃癌SGC-7901細胞,并通過G418篩選穩(wěn)轉細胞株。⑼熒光顯微鏡觀察轉染熒光載體的細胞株,RT-PCR和Western-blot檢測c-jun、β3GnT8和CD147的mRNA和蛋白表達;流式細胞術及Lectin-blot檢測c-jun對細胞糖蛋白中多聚乳糖胺鏈的表達影響;細胞增殖和細胞周期實驗檢測轉染c-jun后細胞增殖能力的變

4、化。
　　結果：①Transwell小室檢測四株結腸癌細胞株中侵襲和遷移能力發(fā)現(xiàn)結腸癌細胞株的轉移能力從低到高依次為LS-174T,SW620,SW480,LoVo。②Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)隨著結腸癌轉移程度的增加,β3GnT8和HG-CD147的表達也隨之升高,且β3GnT8和HG-CD147的表達具有一定的相關性。③流式細胞術和Lectin-blot實驗結果顯示,多聚乳糖胺鏈的表達也隨著結腸癌轉移程度的增加而升高,并

5、且被多聚乳糖胺鏈修飾的CD147糖蛋白的分子量大小在49 kDa-90 kDa之間。④LS-174T中β3GnT8上調后,與空白對照組相比, HG-CD147的糖基化表達升高,其侵襲和遷移能力也增強;LoVo細胞中β3GnT8下調后,與空白對照組相比,HG-CD147的糖基化表達下降,其侵襲和遷移能力也降低。⑤構建c-jun正義表達載體,正反向測序結果在NCBI基因庫中BLAST同源檢索后顯示正義載體中插入的c-jun目的片段正確。⑥通

6、過熒光顯微鏡觀察、RT-PCR、western-blot等檢測,c-jun正義表達載體成功轉入細胞并得到穩(wěn)定轉染細胞株SGC-7901。⑦Western-blot檢測發(fā)現(xiàn),c-jun基因上調后,與對照組相比β3GnT8和HG-CD147的表達均升高。(8)細胞增殖和細胞周期實驗檢測發(fā)現(xiàn),c-jun基因上調后,與對照組相比細胞增殖能力增強。
　　結論：⑵四株結腸癌細胞株的轉移能力從低到高依次為LS-174T,SW620, SW480