無精癥患者誘導多能干細胞系的建立及其在體外分化成原始生殖樣細胞的研究.pdf

1、第一部分：建立無精癥患者誘導多能干細胞系
　　目的：
　　建立無精癥患者誘導多能干細胞系，為進一步研究該疾病的發(fā)病機制和治療提供合適的細胞模型。
　　方法：
　　利用仙臺病毒非基因整合的方法，我們建立了無精癥患者外周血單個核細胞來源的誘導多能干細胞系。采用無血清完全培養(yǎng)基（TeSR2）和胚胎干細胞培養(yǎng)基（Stem Adhere Defined Matrix）限定培養(yǎng)體系進行培養(yǎng)，應用免疫熒光染色、染色體核型分析、

2、擬胚體和畸胎瘤實驗對iPSCs系的干性、多能性、體內(nèi)外分化能力進行驗證。
　　結(jié)果：
　　我們建立了具有人胚胎干細胞特征的無精癥患者來源的iPSCs系。免疫熒光染色顯示，這些細胞均表達SOX2和 OCT4以及TRA-1-60和SSEA-4干細胞多能性基因；染色體核型分析顯示正常的核型；擬胚體和畸胎瘤實驗表明其在體內(nèi)、體外具有向三個胚層分化的能力。
　　結(jié)論：
　　利用非基因整合方法成功構(gòu)建了無精癥患者外周血來源的

3、誘導多能干細胞系，為無精癥發(fā)病機制的研究及治療提供了細胞模型。
　　第二部分：無精癥患者iPSCs在體外分化成原始生殖樣細胞的研究
　　目的：
　　將建立的無精癥患者誘導多能干細胞（Patients with azoospermia induce pluripotent stem cells，pa-iPSCs）在體外定向誘導分化為原始生殖樣細胞（primordial germ cell-like cells,PGCLC

4、s）。
　　方法：
　　我們利用“4i”(PD0325901+CHIR99021+SB203580+SP600125)的培養(yǎng)體系將無精癥患者來源iPSCs轉(zhuǎn)化成naive iPSCs，然后將naive iPSCs在體外在含有bFGF、TGF-β1和1％KSR的預誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，然后以2000-4000個細胞/孔傳到低吸附的96孔板中，細胞培養(yǎng)在含BMP4、LIF、SCF、EGF、和ROCK inhibitor PGCL

5、Cs的分化培養(yǎng)基中。并用免疫熒光染色的方法對PGCLCs進行了特異標記鑒定。
　　結(jié)果:
　　我們成功將iPSCs轉(zhuǎn)變成了nave態(tài)iPS細胞，然后在體外成功誘導出PGCLCs，免疫熒光染色顯示PGCLCs表達PGC的特異標記OCT4，SOX17。
　　結(jié)論：
　　通過“4i”體系將pa-iPSCs轉(zhuǎn)變成naive狀態(tài)的干細胞，并將其在體外誘導分化成了PGCLCs，PGCLCs表達PGC的特異標記SOX17和OC