題目一：miR-17-20a調(diào)控TGF-β通路抑制食管癌浸潤轉(zhuǎn)移的機制研究題目二：miR-92b調(diào)控ITGAV抑制食管癌浸潤轉(zhuǎn)移的機制研究.pdf

1、第一部分、miR-17/20a調(diào)控TGF-β通路抑制食管癌浸潤轉(zhuǎn)移的機制研究
　　作為非編碼小RNA分子，microRNA能夠通過對靶基因的直接影響從而調(diào)控腫瘤進程，其在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中的功能和作用越來越受到人們的關(guān)注。本實驗室前期通過chemotaxis模型篩選，得到了運動能力存在顯著差異的4種食管癌細胞亞型，即30-U/D和180-U/D。對它們進行microRNA芯片分析后，我們發(fā)現(xiàn)miR-17和miR-20a在運動能力較弱的

2、“U”細胞亞群中高表達，提示二者可能與食管癌的運動相關(guān)。miR-17/20a屬于miR-17-92癌基因簇，許多研究報道了二者在多種類型腫瘤進展中的作用，但在食管癌中卻鮮有報道。本研究旨在探究miR-17/20a在食管癌中的功能及調(diào)控機制。
　　首先，我們利用RT-qPCR實驗進行了microRNA芯片結(jié)果驗證。與30-D和180-D相比，miR-17/20a在30-U和180-U中的表達較高。通過后續(xù)的體外功能實驗，我們發(fā)現(xiàn)mi

3、R-17/20a能夠顯著抑制食管癌細胞的運動和浸潤能力，對細胞增殖和細胞凋亡的作用則比較微弱。通過數(shù)據(jù)庫預測，我們得到了多個miR-17/20a的潛在下游靶基因。Luciferase reporter，Western Blotting及tranwell功能實驗結(jié)果表明TGFBR2和SARA是miR-17/20a的功能性靶基因，能夠影響食管癌細胞的運動和浸潤能力。研究表明TGFBR2和SARA均參與到TGF-β通路之中。由于功能的復雜性和

4、靈活性，TGF-β通路既可以發(fā)揮抑癌的作用，又可以促進腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。本實驗室前期已證實TGF-β能夠促進食管癌細胞的運動，因此我們進一步探究miR-17/20a能否影響TGF-β通路的活化。在30-D細胞中，高表達miR-17/20a能夠顯著抑制Smad2的磷酸化，而在180-U細胞中敲降miR-17/20a后，Smad的磷酸化水平顯著升高。Smad2作為核心組分，其磷酸化水平直接反映了TGF-β通路的活性。在加入TGF-β1后，30

5、-D細胞的運動能力顯著增加。以上結(jié)果表明miR-17/20a能夠抑制TGF-β通路從而削弱了食管癌細胞的運動和浸潤能力。
　　在體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移模型中，我們發(fā)現(xiàn)miR-17/20a抑制了食管癌細胞發(fā)生肺阻滯，這反映了二者對食管癌浸潤轉(zhuǎn)移的抑制作用。根據(jù)臨床組織標本檢測結(jié)果及GEO數(shù)據(jù)庫信息，我們發(fā)現(xiàn)TGFBR2和SARA在食管癌組織和癌旁正常組織中的表達并無顯著差異。
　　綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)miR-17/20a能夠抑制食管癌

6、細胞的運動和浸潤能力，且對細胞增殖和凋亡無顯著影響。作為miR-17/20a的功能性靶基因，TGFBR2和SARA能夠影響食管癌細胞的運動和浸潤，但在癌和癌旁組織中表達無顯著差異。miR-17/20a能夠通過抑制TGF-β通路從而發(fā)揮對食管癌細胞運動和浸潤的抑制作用。本研究加深了我們對miR-17/20a在食管癌浸潤轉(zhuǎn)移中作用的認識，闡明了miR-17/20a在食管癌中的調(diào)控機制，為食管癌的臨床治療和藥物開發(fā)提供了新的思路和理論依據(jù)。<

7、br>　　第二部分、miR-92b調(diào)控ITGAV抑制食管癌浸潤轉(zhuǎn)移的機制研究
　　Integrin蛋白是一種胞外基質(zhì)的跨膜粘附受體，不僅能夠介導細胞與胞外基質(zhì)的粘附，還可以調(diào)節(jié)胞內(nèi)信號通路從而影響相關(guān)生物學進程，對腫瘤細胞的運動和浸潤十分重要。Integrin家族共有26個成員，其中包括18種α亞基和8種β亞基，它們以異二聚體的形式發(fā)揮功能。本實驗前期研究發(fā)現(xiàn)miR-92b能夠直接作用于ITGA6并抑制其表達，從而削弱了食管癌細胞

8、的運動和浸潤能力。而通過數(shù)據(jù)庫分析，我們發(fā)現(xiàn)ITGAV也可能是miR-92b的下游靶基因，為此我們在食管癌中進行了相關(guān)研究來探究二者之間的相互作用關(guān)系及對食管癌浸潤轉(zhuǎn)移的影響。
　　首先，我們選取了3種運動能力存在顯著差異的食管癌細胞(30-D，KYSE450和KYSE510)，通過RT-qPCR實驗分別檢測了miR-92b和ITGAV的表達情況，發(fā)現(xiàn)二者呈負相關(guān)關(guān)系，且隨著細胞運動能力的減弱，ITGAV的表達也隨之下降。瞬時過表

9、達或敲降實驗結(jié)果表明miR-92b能夠調(diào)控ITGAV的表達水平，結(jié)合后續(xù)的Luciferase reporter及transwell功能實驗，確認ITGAV是miR-92b的功能性靶基因，能夠影響食管癌細胞的運動和浸潤能力。
　　隨后，我們對miR-92b參與浸潤轉(zhuǎn)移的分子機制進行了探究。經(jīng)過chemotaxis模型處理后，miR-92b過表達的30-D細胞中，F(xiàn)AK通路受到顯著抑制，并且下游分子Rac1的活性也顯著下降。同樣的結(jié)

10、果在ITGAV被敲降后也被觀察到。另外，加入Rac1抑制劑NSC23766后，30-D細胞的運動能力顯著下降。以上結(jié)果表明miR-92b通過調(diào)控ITGAV-FAK-Rac1信號通路從而發(fā)揮了對食管癌細胞運動和浸潤的抑制作用。
　　在體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移模型中，我們發(fā)現(xiàn)miR-92b能夠通過抑制ITGAV從而減弱了食管癌細胞發(fā)生肺阻滯，且ITGAV并未對食管癌細胞的體內(nèi)增殖產(chǎn)生顯著影響，反映了二者對食管癌浸潤轉(zhuǎn)移的相關(guān)作用。根據(jù)臨床組織標本檢

11、測結(jié)果及GEO數(shù)據(jù)庫信息，我們發(fā)現(xiàn)ITGAV在食管癌組織中高表達且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)。值得注意的是，本實驗室前期結(jié)果顯示miR-92b與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移負相關(guān)，這也體現(xiàn)了miR-92b通過負調(diào)控ITGAV的表達來抑制食管癌細胞的浸潤轉(zhuǎn)移。
　　綜上所述，本研究結(jié)果表明，敲降ITGAV能夠抑制食管癌細胞的運動和浸潤且并不影響增殖，ITGAV為miR-92b的功能性下游靶基因，miR-92b通過調(diào)控ITGAV-FAK-Rac1信號通路